基于碳納米管組裝無電子媒介體電流型乙腦疫苗免疫傳感器研究

董軍

(川北醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川 南充 637000)

乙腦疫苗的含量測定直接影響著其對流行性乙型腦炎的預(yù)防效果。目前，乙腦疫苗含量檢測方法主要有動物法、蝕斑試驗法和酶聯(lián)免疫吸附法，這些經(jīng)典方法使用廣泛但也存在一些不足，例如操作繁瑣、檢測周期較長、靈敏度較低，對實驗人員要求較高等[1-3]。因此，發(fā)展簡捷、靈敏度高的檢測方法不論對醫(yī)學(xué)理論研究還是臨床檢測都具有重要意義。免疫傳感器是利用抗原-抗體間特殊的結(jié)合反應(yīng)來測定痕量物質(zhì)的一種高靈敏度方法，近些年來關(guān)于乙肝病毒、腫瘤標(biāo)記物、甲胎蛋白等免疫傳感器的研究取得了快速發(fā)展[4-6]。但關(guān)于乙腦免疫傳感器的研究相對缺乏，仍有大量基礎(chǔ)工作需要完善。其中如何提高抗體活性負載量及信號靈敏度是亟待解決的關(guān)鍵問題之一[7-8]。

碳納米管獨特的結(jié)構(gòu)和電學(xué)性質(zhì)使其在傳感器領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。研究表明碳納米管可發(fā)揮分子導(dǎo)線作用，利于生物分子與電極間的電子傳遞，在生物傳感方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性質(zhì)[9-10]。Wang等[11]認為碳納米管可以和生物兼容性更好的材料結(jié)合，這樣不但可以提高生物活性物質(zhì)負載量，而且可以更好保持生物分子活性，提高傳感器的響應(yīng)信號。據(jù)此，本研究以多壁碳納米管為載體提高生物兼容性較好的金微粒負載量，從而提高乙腦疫苗抗體固定量，并保持抗體良好的生物活性；利用辣根過氧化氫酶對H2O2的反應(yīng)增強電流信號，提高響應(yīng)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

循環(huán)伏安法、恒電位法和計時電流法在LK98BⅡ綜合電化學(xué)分析系統(tǒng)(天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司)測量；PHS-2F型酸度計 (上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，BS110S電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)；KQ—400DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，工作頻率為 60 kHz。實驗采用三電極體系，修飾過的玻碳電極 (GC) 為工作電極，飽和甘汞電極 (SCE) 為參比電極，鉑片電極為對電極。

多壁納米碳管(MWCNT，深圳市納米港有限公司)，乙腦疫苗、乙腦疫苗疫苗抗體、腮腺炎疫苗、水痘疫苗和風(fēng)疹疫苗(上?？迫A生物工程公司提供)；氯金酸(四川化學(xué)試劑廠)，辣根過氧化物酶(HRP)及牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，美國)，所用化學(xué)試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 傳感器制備方法 Au/MWCNT/GC電極制備方法：MWCNT(10～30 nm)的氧化處理參考文獻[12]。取碳納米管1.0 g，在濃HCl中回流3 h純化，洗滌至中性，再將碳納米管置于濃HNO3中回流4 h，洗滌至中性后在120 ℃下烘干，制得羧基化碳納米管。稱取羧基化的MWCNT 10 mg用10 mL 十六烷基胺超聲震蕩分散2 h，配成帶有氨基，濃度為1 mg/mL的羧基化碳納米管分散系。玻碳電極(?：2 mm)用1800#、2000#均相砂紙拋光，重蒸水沖洗3次，再依次在丙酮、10%的氫氧化鈉、HNO3(v)∶H2O(v)=1∶1的溶液中超聲振蕩三分鐘，取出重蒸水沖洗，置于室溫下干燥；滴加1 mg/mL的黑色溶液3 μL，紅外燈烤干，以該電極為工作電極，在三電極體系中，-2.5 V恒電壓下電沉積 120 s。電沉積完成后，取出電極，重蒸水沖洗2次，室溫下過夜干燥得到Au/MWCNT/GC電極。

免疫傳感器的制備方法：將Au/MWCNT/GC電極置于乙腦疫苗抗體溶液中在4 ℃浸泡4 h，再將電極置于0.25% BSA溶液中于常溫孵育2 h以封閉活性基團，最后用1 mg/mL HRP取代BSA封閉非特異性活性位點，在37 ℃恒溫封閉30 min，制得HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器。圖1所示為免疫傳感器制備流程圖。

1.2.2 測試方法 組裝不同階段電極的電化學(xué)表征：電極在組裝過程中的不同階段用循環(huán)伏安法進行表征。三電極體系，于含0.1 mol/L KCl 與0.2 mol/L PBS (pH7.4)溶液中在0～1 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃描前PBS溶液通氮氣5 min。

免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇：采用三電極體系，以HRP/乙腦疫苗抗體/Au/ MWCNT/GC免疫傳感器為工作電極。在含6.4×10-7lg pfu/mL的乙腦疫苗磷酸鹽生理緩沖溶液(pH 7.4)中，采用計時電流法記錄不同時間電流穩(wěn)定后的電流值(I)，并用I相對于電沉積時間(t)做圖，通過該圖討論免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇。

免疫傳感器對乙腦疫苗響應(yīng)：三電極體系，免疫電極為工作電極，先測量在0.5×10-3mol/L H2O2+0.1 mol/L KCl+2 mmol/L PBS (pH7.4)電解質(zhì)溶液中的電位I0(空白電位)，然后向電解質(zhì)溶液中加入不同濃度的乙腦疫苗溶液，攪拌4 min，記錄相應(yīng)電位值I，傳感器對系列濃度乙腦疫苗溶液的電流響應(yīng)按公式：△I=I0-I進行計算。由于抗原與固定在電極上的抗體結(jié)合后，生成的抗原-抗體復(fù)合物堵塞導(dǎo)電通道，使得電子有效擴散面積減小，電流減小，因此響應(yīng)電流值I與乙腦疫苗濃度成反比，最后用△I對lgC(乙腦疫苗)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件選擇

2.1.1 電沉積時間對電流影響 圖2是Au/MWCNT/GC電極的響應(yīng)電流與時間關(guān)系圖，其中峰電流(Ip)根據(jù)該電極在2.5 mmol/L Fe(CN)64-/3-+0.1 mol/L KCl+PBS(pH7.4)溶液中循環(huán)伏安曲線中位于-0.26 V和0.10 V處觀察到的氧化還原峰，利用公式Randles-Sevcik 方程：Ip=2.69×105AD1/2n3/2γ1/2C(D，n，γ和C均為常數(shù)，電極的電活性表面積(A)與氧化還原峰的峰電流之間成正比)計算得到[13]。從圖中可看出，電沉積時間與峰電流并不會隨著Au含量的增加而增加，而是沉積時間為120 s時，Au/MWCNT/GC電極的響應(yīng)峰電流值出現(xiàn)最大值，Ip(120)是沉積時間分別為 90 s 和 150 s 的峰電流的 1.2 倍和1.1倍。這主要是因為金微粒的堆積及分布方式不同造成，沉積時間較短時，金粒子多數(shù)為納米或微米級，并能夠充分與納米碳管接觸，但時間過短時金微粒沉積較少，隨著時間的延長，碳納米管表面能夠充分負載金粒子，且金粒子相對均勻，粒徑可保持在微米級以下，有效利用碳納米管的空間結(jié)構(gòu)和高比表面積，導(dǎo)電有效面積更大；而更長時間的電沉積雖然金含量增加，但完全覆蓋碳納米管，會形成較為光滑金面，金顆粒粒徑不斷增大，反而會使有效導(dǎo)電面積減小，因此峰電流也會降低。

2.1.2 免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇 圖3為HRP/乙腦疫苗抗體/Au/ MWCNT/GC免疫傳感器與乙腦疫苗的動力學(xué)響應(yīng)曲線。從圖中可看出，在測試時間范圍，傳感器表面負載抗體與緩沖溶液中抗原的反應(yīng)可分為兩個階段，即抗原-抗體快速結(jié)合階段和抗原-抗體反應(yīng)達到平衡階段。在快速響應(yīng)階段，免疫電極表面上的抗體與溶液中的抗原迅速結(jié)合，形成非良性導(dǎo)電體的抗原-抗體復(fù)合物，由于免疫復(fù)合物導(dǎo)電性很弱，增大了電子擴散阻力，減弱電子向電極表面的擴散，從而會減少復(fù)合電極的有效導(dǎo)電面積，從而響應(yīng)電流值明顯減小；隨著時間的延長，至4 min左右，響應(yīng)電流基本達到穩(wěn)定，表明抗原-抗體結(jié)合達到平衡，因此本實驗選用的最佳培育時間是4 min。

2.1.3 免疫傳感器在抗原溶液中培育溫度及pH的選擇 圖4分析了溫度(a)和pH(b)對免疫反應(yīng)影響。從圖4a可以看出溫度在15 ℃至37 ℃范圍，響應(yīng)電流會隨著溫度的升高逐漸減小，37 ℃時達到最小，約57 μA，這說明抗原—抗體結(jié)合密度達到最大，但溫度超過37 ℃時，電流強度反而會隨著溫度的升高而升高，這歸因于抗原、抗體的活性在較高溫度下易被破壞，不利于兩者的結(jié)合。實驗中由于溫度升高，部分免疫復(fù)合體被破壞，電極表面部分被免疫復(fù)合體堵塞的導(dǎo)電通道會恢復(fù)，所以響應(yīng)電流增大。故本實驗選用37 ℃為操作溫度。

pH對免疫傳感器電流響應(yīng)的影響(如圖4b所示)與溫度對免疫反應(yīng)影響相類似。pH值過高或過低都不利于抗原-抗體復(fù)合體的形成，實驗結(jié)果表明該感器的最適反應(yīng)pH為7.4。

2.2 電極在組裝過程的電化學(xué)表征

圖5中曲線1-4是不同的修飾電極在0.1 mol·L-1KCl+2 mmol·L-1PBS (pH7.4)溶液中的循環(huán)伏安曲線圖。與玻碳電極相比(線1)，表面修飾一層MWCNT的玻碳電極(線2)充擴散電流明顯增大，在0.3 V處明顯有一對氧化還原峰，這是因為經(jīng)氧化處理的MWNCT表面含有以羧基、羰基和羥基為主的活性基團。而0.3 V處氧化還原峰是由于羧基在電極上被還原為羥基，又再次氧化成羧基的結(jié)果[14]。當(dāng)金微粒沉積在MWCNT上(線3)，電極的充擴散電流及氧化還原峰都顯著增強，這是因為具有優(yōu)良導(dǎo)電性Au微粒組裝在MWCNT/GC電極上后，促進了電子轉(zhuǎn)移。但是當(dāng)HRP及乙腦疫苗抗體固定在Au/MWCNT修飾的電極表面后(線4)，電極的沖擴散電流明顯減小，這是由于非良導(dǎo)體的抗原及HRP占據(jù)并阻斷了部分導(dǎo)電通道，使得電子向電極表面擴散的阻力增大，有效導(dǎo)電面積減小，電流減小。圖5中線5～線7分別為HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器在含0.1 mmol/L、0.3 mmol/L及0.5 mmol/L H2O2的磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以明顯觀察到，隨著PBS中H2O2濃度的增加，峰電位移動到約0.4 V，循壞伏安曲線的充擴散電流及氧化還原峰電流值都有一定增強。這是由于MWCNT能促進HRP的直接電子轉(zhuǎn)移[15]，故充擴散電流、峰電流及峰電位會有不同程度的增大，這證明HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器對H2O2有良好的電催化還原作用，當(dāng)H2O2濃度達到0.3 mmol/L時，電流不再明顯增加，因此PBS溶液中含H2O2濃度0.3 mmol/L為最佳濃度。

2.3 免疫傳感器的響應(yīng)性能和檢出限

由于HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器中的MWCNT能促進HRP的直接電子轉(zhuǎn)移，因此，該無電子媒介體的電流型免疫傳感器可用于乙腦疫苗的檢測。為測量傳感器的響應(yīng)性能和檢出限，在25 ℃下，用免疫傳感器對0.1 mol·L-1KCl+2 mmol·L-1PBS (pH7.4)溶液重復(fù)測定7次，設(shè)峰電流值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3 μA，將其作為免疫傳感器的噪音值(I0)。記錄免疫傳感器在不同濃度乙腦疫苗標(biāo)準(zhǔn)溶液中的電流強度，計算這些電流與空白磷酸鹽緩沖液的電流之差。結(jié)果如圖6a所示，在所測范圍內(nèi)響應(yīng)電流與乙腦疫苗濃度對數(shù)呈現(xiàn)“S”線性關(guān)系，但該傳感器在5.6×10-8～2.2×10-6lg pfu/mL的范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系(圖6b線1所示)，回歸方程為：△I=0.1407+0.1358 lgC[乙腦疫苗]，r=0.9929，靈敏度72.4 μA/lg pfu/mL/cm2。與HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT /GC電極相比，HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC電極的線性范圍窄 (圖6b線2)，靈敏度低(6.3×10-8-7.2×10-7lg pfu/mL，靈敏度48.5 μA/lg pfu/mL/cm2)。這是因為多壁碳納米管的高比表面積提高了金微粒的負載量，且金微粒很可能是納米或微米級別的，這些微粒具有大的比表面積，從而有效提高了抗體的固定量，金微粒還能有效保持抗體的活性，從而有效促進了電子傳輸，提高了電極的靈敏度。

2.4 免疫傳感器的特異性

實驗考察了腮腺炎疫苗、水痘疫苗和風(fēng)疹疫苗對乙腦免疫傳感器的響應(yīng)程度。測量同一批次制備的3支免疫傳感器分別置于含5.0×10-7lg pfu/mL乙腦疫苗的磷酸緩沖溶液中的響應(yīng)電流，然后向每支免疫傳感器的緩沖溶液中加入一種干擾疫苗，再分別測定其響應(yīng)電流。實驗結(jié)果表明(表1)，含干擾物溶液中的電流響應(yīng)值與只含乙腦疫苗的磷酸緩沖溶液中的響應(yīng)電流無顯著性差異，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

表1 免疫傳感器的特異性

2.5 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

重現(xiàn)性是免疫傳感器的重要性質(zhì)之一。將一支乙腦免疫傳感器與5.0×10-7lg pfu/mL的乙腦疫苗樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液進行7次反應(yīng)，檢測其電流響應(yīng)，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為16% (n=7)。另外，取七支免疫傳感器，對濃度為5.0×10-7lg pfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品進行檢測，結(jié)果RSD=7.1% (n=7)，結(jié)果表明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

穩(wěn)定性是決定免疫傳感器性能好壞的關(guān)鍵因素之一，在本實驗中，將制備的HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC電極在4 ℃下干態(tài)放置60 d，放置期間每隔10 d對同一濃度的乙腦抗原進行檢測，前30天其響應(yīng)電流仍能保持初始電流的93.2%，60 d后電流值只有初始電流值的87.4%。通過免疫傳感器在磷酸緩沖溶液中進行的100片段的循環(huán)伏安掃描，與初始電流相比，其響應(yīng)電流丟失3.14%。免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性，主要是因為碳納米管對金粒子起到能夠較好的分散作用，而乙腦抗體能夠有效的固定在金微粒表面，并保持良好的生物活性。

2.6 回收實驗

將制備的乙腦免疫傳感器用于4批生物制品乙腦疫苗的效價的檢測，回收率為98.17%～106.44%(表2)，表明該傳感器實驗結(jié)果與傳統(tǒng)蝕斑法結(jié)果基本一致。

表2 乙腦免疫傳感器回收率

綜合上述實驗，可以得出結(jié)論多壁碳納米管與金粒子的結(jié)合使用可增加乙腦抗體的固定量；且兩者的協(xié)同作用有利于電子向傳感器表面的擴散，整個電催化過程無需電子媒介體，因此傳感器制備過程相對簡便，利用碳納米管對辣根過氧化氫酶電子轉(zhuǎn)移的促進作用，提高傳感器的響應(yīng)靈敏度。但有效測量范圍還是相對較小，在這方面仍然需要繼續(xù)探索。簡而言之，HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC傳感器對乙腦疫苗檢測具有可行性，但在有效測量范圍和靈敏度等方面還需做大量基礎(chǔ)工作。