牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發(fā)病的可能機(jī)制研究

周婷，吳艷

(1.四川省第四人民醫(yī)院第一門(mén)診部口腔科，四川 成都 610000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，四川 南充 637000)

牙周炎指的是牙周支持組織的慢性炎性疾病，可導(dǎo)致不可逆地侵襲與破壞牙周組織，使牙周喪失再生與修復(fù)能力，導(dǎo)致牙齒松動(dòng)及脫落[1]。牙周炎是導(dǎo)致成人牙齒缺失的最主要原因之一，中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等口腔微生物與牙周炎的發(fā)生與發(fā)展存在密切相關(guān)性[2]。牙周膜細(xì)胞是牙周膜中最主要的組成部分，在牙周組織的保護(hù)及修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[3]。炎癥復(fù)合體是由胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體家族成員之一，其中NLRP3炎癥復(fù)合體研究最為廣泛[4]。NLRP3炎癥復(fù)合體可以激活促炎性蛋白酶caspase-1，而活化的caspase-1可切割白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)與IL-18前體，促進(jìn)IL-1β與IL-18的成熟及分泌[5]。本研究旨在探討牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發(fā)病的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2015年1月至2017年12月四川省第四人民醫(yī)院進(jìn)行慢性牙周炎拔牙治療的患者128例作為觀察組，以同期進(jìn)行健康體檢的牙周健康的128例健康人員作為對(duì)照組。觀察組中男性54例，女性74例，平均年齡(37.1±4.4)歲；對(duì)照組中男性59例，女性69例，平均年齡(37.6±4.7)歲。比較兩組之間的性別與年齡分布，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)無(wú)吸煙史；(3)近1個(gè)月內(nèi)未曾服用非甾體抗炎及抗菌藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠及哺乳期婦女。

1.3 方法

采用無(wú)菌齦下刮治器刮取觀察組患者磨牙牙周袋最深位點(diǎn)及對(duì)照組上頜第一磨牙頰側(cè)近中位點(diǎn)菌斑，采用紗布隔濕干燥，將標(biāo)準(zhǔn)化滅菌紙的紙尖插至牙周袋的底部，插入10 s之后將滅菌紙取出放置于含有1 mL pH=7.2 PBS溶液的EP管中，采用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行檢測(cè)，位點(diǎn)探診深度(PD)≥4 mm，附著水平(AL)≥3 mm，臨床附著喪失(CAL)≥1 mm。將觀察組需要拔除的牙齒拔除，于無(wú)菌條件下刮取超過(guò)1/3的牙周膜組織，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，部分細(xì)胞采用牙齦卟啉單胞菌ACTT33277進(jìn)行感染，部分不進(jìn)行感染處理，加入蛋白酶抑制劑以及裂解液進(jìn)行蛋白提取液制備，采用Western Blot對(duì)NLRP3蛋白進(jìn)行檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)IL-1β與IL-18的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率比較

觀察組牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率為82.0%，顯著高于對(duì)照組牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率18.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2 兩組患者不同探診深度牙齦卟啉單胞菌濃度比較

在5 mm、6 mm、7 mm的探診深度時(shí)，觀察組牙齦卟啉單胞菌濃度均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

組別5 mm例數(shù)濃度6 mm例數(shù)濃度7 mm例數(shù)濃度觀察組364.2±0.5594.9±0.7335.6±0.7對(duì)照組810.4±0.1330.5±0.2140.8±0.2t值31.25833.04737.204P值0.0010.0010.001

2.3 觀察組牙周膜細(xì)胞是否進(jìn)行牙齦卟啉單胞菌感染的NLRP3、IL-1β與IL-18表達(dá)比較

觀察組進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細(xì)胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達(dá)水平顯著高于未進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

組別NLRP3IL-1β(pg/mL)IL-18(pg/mL)進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染1.4±0.31865.3±389.4320.1±44.6未進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染0.7±0.11125.8±306.7121.5±39.7t值18.9737.65322.846P值0.0010.0010.001

3 討論

慢性牙周炎患者的主要臨床表現(xiàn)為牙齒松動(dòng)、牙齦溢膿、口臭、咀嚼無(wú)力等，不僅對(duì)患者的口腔衛(wèi)生造成一定危害，還與糖尿病、冠心病、消化系統(tǒng)疾病存在密切相關(guān)性[6]。機(jī)體抵御病原微生物的第一道天然屏障即為機(jī)體先天免疫系統(tǒng)，其在機(jī)體抗感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。牙周炎的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果[8]，具體包括：(1)牙菌斑的作用；(2)中性粒細(xì)胞多形核白細(xì)胞防御缺陷；(3)全身易感因素如基因缺陷、吞噬細(xì)胞功能缺陷、免疫缺陷等的影響；(4)炎性因子升高。本研究旨在探討致慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌感染與NLRP3、 IL-1β與IL-18表達(dá)情況，分析慢性牙周炎發(fā)生的可能機(jī)制。

人類(lèi)口腔中定植有500種左右的細(xì)菌，但大部分并非致病菌，慢性牙周炎的可疑致病微生物主要包括福賽類(lèi)桿菌、變黑普氏菌、牙密螺旋體、中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等[9-10]。牙齦卟啉單胞菌為一種革蘭陰性厭氧菌，具有菌毛、外膜蛋白、牙齦素、膜泡等多種毒力因子，定植于口腔中的多種組織內(nèi)，與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)[11]。牙齦卟啉單胞菌的主要致病力與牙齦蛋白酶、脂多糖、吲哚、有機(jī)酸等有關(guān)，牙齦卟啉單胞菌介導(dǎo)下的牙周炎性反應(yīng)是慢性牙周炎的主要發(fā)病的可能機(jī)制之一[12-13]。本研究結(jié)果顯示，慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率為82.0%，顯著高于健康人群牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率18.0%，該結(jié)果提示慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌感染居于較高水平，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致，應(yīng)引起重視；牙周健康人群中牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率18.0%，提示牙齦卟啉單胞菌感染并非一定會(huì)導(dǎo)致慢性牙周炎的發(fā)生。據(jù)報(bào)道[14]，牙齦卟啉單胞菌感染達(dá)到一定水平才能引起慢性牙周炎。本研究結(jié)果顯示在5 mm、6 mm、7 mm的探診深度時(shí)，觀察組牙齦卟啉單胞菌濃度均顯著高于對(duì)照組，該結(jié)果提示牙齦卟啉單胞菌感染達(dá)到一定水平是導(dǎo)致慢性牙周炎的關(guān)鍵原因。

NOD樣受體(NLRs)是存在于細(xì)胞質(zhì)中識(shí)別病原微生物相關(guān)分子模式的模式識(shí)別受體，在發(fā)生病原微生物感染后會(huì)與特定蛋白形成蛋白復(fù)合體，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中控制炎性因子的成熟及分泌[15]。NLRP3為NLRs家族的一個(gè)重要炎癥復(fù)合體，主要由NLRP3的框架蛋白、caspase-1、CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣接頭蛋白構(gòu)成，而活化的caspase-1可切割I(lǐng)L-1β與IL-18前體，促進(jìn)IL-1β與IL-18的成熟及分泌[5]。本研究結(jié)果顯示觀察組進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細(xì)胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達(dá)水平顯著高于未進(jìn)行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細(xì)胞。該結(jié)果提示牙齦卟啉單胞菌感染可以導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞中NLRP3表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致牙周組織發(fā)生損壞。

綜上所述，慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性率及感染濃度均處于較高水平，牙齦卟啉單胞菌感染致慢性牙周炎發(fā)患者的牙周膜細(xì)胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達(dá)水平較高，這可能是牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發(fā)病的機(jī)制之一。