抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值

蔡艷娟，杜娟，盧小嵐，王強(qiáng),2，凡瞿明，王東生

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 南充 637000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)炎癥導(dǎo)致的關(guān)節(jié)損傷和功能喪失為主要表現(xiàn)的最常見的自身免疫疾病之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率約1%，在我國發(fā)病率為0.3%～0.6%。部分RA患者在發(fā)病2年即可出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的骨關(guān)節(jié)破壞而致關(guān)節(jié)畸形，進(jìn)而喪失運(yùn)動(dòng)能力[1-2]。因此，早期診斷及盡早采取適宜的治療，對于預(yù)防關(guān)節(jié)的損傷非常重要。

類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽(anti-CCP)抗體作為重要的實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)被列入2009年10月美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)新公布的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)中[3-4]。近年來，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)抗突變型瓜氨酸波形蛋白(anti-MCV)與RA密切相關(guān)。本研究采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫法檢測血清中抗MCV，并與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA作對比分析，探討抗MCV在診斷RA的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 RA組 2017年4月至2017年6月就診于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕血液科門診及住院的RA患者79例(所有患者均符合ACR/EULAR2009的RA診斷標(biāo)準(zhǔn))。其中，男性21例，女性58例，年齡16～84歲，平均(52.20±14.25)歲。

1.1.2 非RA結(jié)締組織病組 同期入院的非RA自身免疫性疾病51例，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)16例，未分化結(jié)締組織病(UCTD)19例，干燥綜合征(SS)6例，系統(tǒng)性硬化病(SSC)4例，強(qiáng)直性脊柱炎(AS)4例及其他結(jié)締組織病2例，均符合國內(nèi)外相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，男性22例，女性29例，年齡37～70歲，平均(45.56±9.79)歲。

1.1.3 正常對照組 同期來川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康者40例。其中，男性18例，女性22例，年齡25～61歲，平均(45.60±10.67)歲。

1.2 樣本的收集

所有研究對象均采集空腹靜脈血，收集3～5mL于無抗凝劑管中，37℃孵育至血液凝集完全，3 500 r/min離心5 min后取血清，用于檢測血清中抗MCV、抗CCP、RF IgA、RF IgG和RF IgM濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

抗MCV、RF IgA和RF IgG的檢測試劑為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 定量檢測抗MCV試劑盒，購自德國Orgentec公司；其檢測儀器為德國Orgentec公司Alegria全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀?？笴CP的檢測試劑為抗環(huán)瓜氨酸肽抗體CMIA試劑盒，購自美國雅培公司；其檢測儀器為雅培化學(xué)發(fā)光分析儀i2000SR。RF IgM采用速率散射比濁法檢測，其檢測儀器為美國Beckman-Coulter公司的Immage 800雙光徑免疫濁度分析儀，其檢測試劑為Beckman-Coulter公司配套的RF IgM檢測試劑盒。

1.4 測定方法

1.4.1 血清抗MCV、RF IgA和RF IgG的測定 采用Orgentec Alegria全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀檢測血清中抗MCV、RF IgA和RF IgG的含量。嚴(yán)格按儀器SOP操作規(guī)程上機(jī)檢測。

1.4.2 血清抗CCP的測定 采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清中抗CCP的含量。嚴(yán)格按照雅培I2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的操作程序來檢測樣本。

1.4.3 血清RF IgM的測定 采用速率散射比濁法檢測血清中RF IgM的含量。嚴(yán)格按照Immage 800雙光徑免疫濁度分析儀的操作程序來檢測樣本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均采用表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析；采用受試者工作特征(ROC)曲線評價(jià)抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的診斷效能，曲線下面積比較采用Ζ檢驗(yàn)；采用四格表計(jì)算抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA單獨(dú)及其聯(lián)合檢測在診斷RA的靈敏性(Sen)、特異性(Spe)；RA組抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA的陽性率比較采用配對設(shè)計(jì)χ2檢驗(yàn)；多組間百分率的比較采用χ2檢驗(yàn)；抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA含量水平比較

采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析法測定血清中抗MCV，化學(xué)發(fā)光法測定抗CCP，發(fā)現(xiàn)RA組患者血清中抗MCV和抗CCP分別為(451.07±40.38)IU/mL、(102.65±9.36)U/mL，較非RA自身免疫性疾病組和正常對照組顯著升高(P<0.01)；但非RA自身免疫性疾病組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采用速率散射比濁法檢測血清中RF IgM，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析法測定RF IgG和RF IgA，結(jié)果顯示：與正常對照組相比，RA組和非RA自身免疫性疾病組患者血清中IgM、IgG、IgA型RF的含量均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；而非RA自身免疫性疾病組比較，RA組RF IgM、RF IgG和RF IgA的含量顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組抗MCV、抗CCP和RF IgM含量水平的比較

*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比； #P<0.01，與AID組相比

2.2 抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的ROC曲線分析

以RA組、非RA自身免疫性疾病組和正常對照組來制作抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA診斷RA的ROC曲線，見圖1。據(jù)ROC曲線取得抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA診斷RA的最佳閾值分別為54.05 IU/mL、3.45 U/mL、25.35 IU/mL、19.95 U/mL、17.00 U/mL；診斷靈敏度分別為：0.931、0.897、0.873、0.782、0.718；診斷特異性分別為0.870、0.846、0.459、0.596、0.702。其中，ROC曲線確定抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的最佳閾值與試劑說明書給出的參考值范圍相近，而抗MCV的最佳閾值卻高出試劑說明書提供的參考值范圍，因此本文采用ROC曲線確定抗MCV的最佳閾值作為陽性閾值。

比較這5個(gè)指標(biāo)的ROC曲線下面積可知，抗MCV的ROC曲線下面積最大，為0.960；然后依次是抗CCP、RF IgM、RF IgA和RF IgG，其曲線下面積分別為0.935、0.780、0.738、0.736。經(jīng)Z檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，抗MCV的曲線下面積與RF IgM、RF IgG、RF IgA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.713，Z=4.711，Z=4.580，P<0.05)；與抗CCP相比，RF IgM、RF IgG、RF IgA的曲線下面積變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ζ=3.067，Ζ=4.008，Ζ=3.898，P<0.05)；而抗MCV與抗CCP、RF IgM與RF IgG、RF IgA間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA在RA組中陽性率比較

比較RA組病例抗MCV陽性檢出率與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的差異發(fā)現(xiàn)，抗MCV抗體陽性率明顯高于RF IgM、RF IgG和RF IgA(P<0.05)；但與抗CCP抗體的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表2抗MCV、抗CCP、RFIgM、RFIgG和RFIgA的ROC曲線分析結(jié)果

項(xiàng)目最佳閾值敏感性(%)特異性(%)AUCSEAUC的95%CI抗MCV54.0589.8791.210.9600.0180.925～0.994抗CCP3.4584.8184.610.9350.0230.891～0.980RF IgM25.3578.4846.150.780?#0.0450.692～0.868RF IgG19.9574.6859.340.736?#0.0440.650～0.822RF IgA17.0072.1570.320.738?#0.0450.650～0.826

注：經(jīng)Z檢驗(yàn)，兩兩比較。*P<0.05，與抗MCV比較；#P<0.05，與抗CCP比較。

表3RA組病例中抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA的陽性率比較

項(xiàng)目抗CCP+-RF-IgM+-RF-IgG+-RF-IgA+-合計(jì)抗MCV +65661105813561571 -261717178合計(jì)671262175920572279χ2值1.1255.8188.64310.562P值0.2890.0120.0020.001

2.4 RA患者中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA間相關(guān)性分析

對RA組病例中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA間均有相關(guān)性(P<0.05)；其中，抗MCV與抗CCP的相關(guān)性(r=0.430，P=0.000)較與其他3項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性更大。見表4。

表4RA病例中抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA間相關(guān)性分析

項(xiàng)目抗CCPRF IgMRF IgGRF IgA抗MCVr值0.4300.2720.2690.343P值0.0010.0160.0170.002

2.5 抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA聯(lián)合檢測的診斷效能分析

根據(jù)抗MCV、抗CCP、RF的敏感性和特異性不同，進(jìn)行兩兩聯(lián)合和全部聯(lián)合檢測，分析比較其診斷效能發(fā)現(xiàn)：抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA聯(lián)合檢測診斷RA的敏感性最高，為98.73%，但敏感性和準(zhǔn)確性最低，分別為56.04%，75.88%；抗MCV/抗CCP聯(lián)合檢測的敏感性最低為92.40%，但特異性和準(zhǔn)確性最高，分別為90.11%及91.18%。見表5。

表5抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA聯(lián)合檢測的診斷效能比較(%)

項(xiàng)目敏感性特異性準(zhǔn)確性陽性似然比陰性似然比抗MCV/抗CCP92.4090.1191.1889.0291.11抗MCV/RF IgM/RF IgG/RF IgA96.2062.6478.2469.0991.94抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA94.9360.4476.4767.5790.16抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA98.7356.0475.8866.1094.44

3 討論

目前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、血清學(xué)指標(biāo)、X線改變；RF和抗CCP是目前最常用且最重要的血清學(xué)指標(biāo)[3-4]。RF是一種抗自身變性IgG分子Fc段的自身抗體，常與自身IgG分子結(jié)合形成穩(wěn)定的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)內(nèi)，引起關(guān)節(jié)損傷；或者沉積于血管壁，激活補(bǔ)體引起壞死性血管炎等[7-8]。血清中RF主要為IgM、IgG和IgA型RF，其含量水平高低與RA的病情活動(dòng)性、病情進(jìn)展程度及預(yù)后密切相關(guān)。雖然RF對RA有一定的相關(guān)性和較好的敏感性，但其可出現(xiàn)于許多非RA結(jié)締組織病、部分腫瘤以及感染患者中，甚至出現(xiàn)于一些正常老年人中，特異性不高，限制了其臨床應(yīng)用?？笴CP是目前廣泛用于RA診斷的血清學(xué)指標(biāo)。近年來，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)抗CCP不僅在RA的診斷中有較高的敏感性和特異性，還與RA疾病活動(dòng)程度以及關(guān)節(jié)侵蝕之間存在顯著的相關(guān)性；而且，抗CCP在未分化關(guān)節(jié)炎患者未來是否發(fā)生RA具有一定的預(yù)測價(jià)值[11]。

波形蛋白是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，它與微管、微絲等在細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)完整的細(xì)胞支撐網(wǎng)絡(luò)體系。波形蛋白在凋亡細(xì)胞內(nèi)經(jīng)由肽酰精氨酸亞氨酶(PAD)的瓜氨酸化，精氨酸被修飾為瓜氨酸，這就改變了原波形蛋白結(jié)構(gòu)變成突變型波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)。MCV在凋亡細(xì)胞內(nèi)因得不到及時(shí)清除而導(dǎo)致瓜氨酸波形蛋白的持續(xù)存在，進(jìn)而促進(jìn)了抗MCV抗體的產(chǎn)生?？筂CV與抗CCP抗體有共同的抗原決定簇(與RA相關(guān)的靶抗原：瓜氨酸)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有相關(guān)性[5,12-13]。因此，抗MCV作為RA新的特異性抗體逐漸成了研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，RA組患者血清中抗MCV含量明顯高于非RA自身免疫性疾病組和正常對照組，與何東儀等[14]報(bào)道的RA患者血清抗MCV水平一致。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，抗MCV診斷RA的最佳閾值為54.05 IU/mL；其ROC曲線下面積為0.940，較RF IgM(AUC=0.780)、RF IgG(AUC=0.736)、RF IgA(AUC=0.738)明顯增加(P<0.05)，但與抗CCP(AUC=0.925)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明抗MCV對RA的診斷價(jià)值與抗CCP相當(dāng)，但要明顯優(yōu)于RF IgM、RF IgG和RF IgA。

本研究發(fā)現(xiàn)抗MCV診斷RA的靈敏度和特異性分別高于抗CCP。分析原因可能是：首先，抗MCV 的抗原來源于天然蛋白，具有多個(gè)潛在的抗原決定簇；而抗CCP的是人工合成的，僅有1～2個(gè)潛在抗原決定簇；因此，抗MCV較抗CCP具有更高的特異性和敏感性[12-13]。其次，本研究采用了ROC曲線確定抗MCV的最佳閾值作為陽性閾值，而非試劑盒提供的參考值。再次，在既往研究中采用手工操作酶聯(lián)免疫測定血清抗MCV，其操作過程復(fù)雜，影響因素較多，而本研究中采用的是全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀來測定，檢測結(jié)果客觀，重復(fù)性好，影響因素少。另外，抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA聯(lián)合檢測，可進(jìn)一步提高診斷RA的敏感度，降低漏診率；這對于RA的早期診斷、早期規(guī)范治療、控制病情、減輕骨關(guān)節(jié)損壞程度，進(jìn)而改善預(yù)后具有至關(guān)重要的作用。

本研究同時(shí)對RA組病例中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA分別進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗MCV與這4項(xiàng)指標(biāo)間均有相關(guān)性(P<0.05)。其中，抗MCV與抗CCP的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為0.430。

綜上所述，抗MCV診斷RA具有較高的敏感性和特異性，且與抗CCP相關(guān)性強(qiáng)，可作為診斷RA的輔助指標(biāo)?？筂CV采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀檢測操作簡單快捷、客觀、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。