牡丹皮不同采收期質(zhì)量綜合評價研究＊

張洪坤，路 麗，黃玉瑤，莫毛燕，王其豐，郭長達(dá)，梁偉龍

(1.亳州市滬譙藥業(yè)有限公司 亳州 236800；2.廣州市香雪制藥股份有限公司 廣州 510663)

牡丹的藥用價值自先秦開始體現(xiàn)，明確記載“牡丹”始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]，之后更多古書典籍[2-6]中提及牡丹的藥用，入藥部位為牡丹的根皮?！吨袊幍洹罚?015版）一部載，牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，秋季采挖根部，除去細(xì)根和泥沙，剝?nèi)「?，曬干或刮去粗皮，除去木心，曬干。前者?xí)稱連丹皮，后者習(xí)稱刮丹皮?？?、辛，微寒。歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱涼血，活血化瘀的功效。用于熱入營血，溫毒發(fā)斑，吐血衄血，夜熱早涼，無汗骨蒸，經(jīng)閉痛經(jīng)，跌撲傷痛，癰腫瘡毒[7]。

牡丹皮主產(chǎn)安徽、四川、甘肅、陜西、湖北、湖南、山東、貴州等地，以銅陵、南陵產(chǎn)的鳳丹皮奉為道地藥材，在海內(nèi)外享有盛譽(yù)，但目前市場上流通量最大、最常用的主流銷售品種是亳州丹皮，而亳州譙城區(qū)所產(chǎn)丹皮銷量較大，占亳州市場交易量的80%-90%，占全國產(chǎn)量的37%左右[8]。根及根莖類藥材一般多在秋季地上部分將枯萎時，以及早春發(fā)芽前或者剛萌發(fā)新苗時采挖，此時根及根莖內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)最豐富，一般說來，此時的有效成分的含量也相對較高[9]。牡丹皮的主要藥效成分和代表活性物質(zhì)包括沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、丹皮酚、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等[10]，2015版《中國藥典》僅以丹皮酚作為指標(biāo)性成分來控制牡丹皮藥材及飲片的質(zhì)量，單一的化學(xué)成分含量高低不能全面反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，亦難以實(shí)現(xiàn)對中藥質(zhì)量的控制。本次實(shí)驗(yàn)通過考察牡丹植株的生長情況、物質(zhì)積累情況，結(jié)合浸出物、多成分多指標(biāo)含量，并采用灰色關(guān)聯(lián)度法多方面綜合評價不同采收期的牡丹皮質(zhì)量情況，以確定牡丹皮的最佳采收期，較以往單一成分控制，更具科學(xué)依據(jù)。

1 材料、儀器與試藥

1.1 樣品

藥材來自亳州市譙城區(qū)魏崗鎮(zhèn)高樓村牡丹皮種植基地，經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司連林生高級工程師鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。

不同采收月份樣品：6年生牡丹植株，2017年3月至2017年12月定期采挖，每月按照梅花點(diǎn)法取樣，分別于固定地塊每個點(diǎn)取樣6株，共30株，取樣點(diǎn)分布（圖1）。

不同生長年限樣品：2017年10月采挖，包括1年-7年生牡丹植株，每生長年限樣品各30株。

每月采收的樣品需將樣品抖凈泥土，測定鮮根重。鮮根用竹刀或碗片刮去外表栓皮，抽去木心，經(jīng)曬干或低溫烘至水分合格，稱干重，去木心的皮層用于各指標(biāo)成分含量測定，每月的樣品經(jīng)處理后當(dāng)月測定各指標(biāo)含量。

1.2 儀器

RHP-250型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司），XS204型電子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo），MS603型電子天平（d=0.01 mg，Mettler Toledo），DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市一恒科學(xué)儀器有限公司），HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海市一恒科學(xué)儀器有限公司），KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD檢測器）。

1.3 試藥

沒食子酸（110831-201204，中國食品藥品檢定研究院，含量以89.9%計(jì)）、兒茶素（110877-201604，中國食品藥品檢定研究院，含量以99.2%計(jì)）、氧化芍藥苷（MUST-16021505，成都曼斯特有限公司，含量以99.93%計(jì)）、芍藥苷（110736-201539，中國食品藥品檢定研究院，含量以96.4%計(jì)）、苯甲酸（100419-200301，中國食品藥品檢定研究院）、丹皮酚（110708-201407，中國食品藥品檢定研究院，含量以99.9%計(jì)）、苯甲酰芍藥苷（MUST-16061803，成都曼斯特有限公司，含量以99.28%計(jì)）、甲醇（AR，20160805-2，廣州化學(xué)試劑廠）、乙醇（AR，161017，西隴化工股份有限公司）、乙腈（色譜純，Merck，批號：JA041430）、磷酸（HPLC，H1503047-500 mL，阿拉?。⒊兯?。

2 方法

2.1 浸出物

取各牡丹皮樣品粗粉約2 g，精密稱定，置150 mL的錐形瓶中，精密加乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1小時后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中、在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算樣品中浸出物的含量（%）。

圖1 梅花點(diǎn)法取樣分布圖

表1 色譜洗脫條件表

圖2 HPLC色譜圖

2.2 多成分含量測定

色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：DAD檢測器；檢測波長：230 nm，258 nm（氧化芍藥苷）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。在此色譜條件下，取對照品、供試品溶液適量，分別進(jìn)樣10 μL測定，HPLC色譜圖（圖2）。

表2 線性關(guān)系結(jié)果

對照品溶液制備 取沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，得質(zhì)量濃度分別為0.5 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的單個對照品溶液。分別精密移取上述各對照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，得質(zhì)量溶度分別為 0.0036 mg·mL-1、0.0030 mg·mL-1、0.0126 mg·mL-1、0.0194 mg·mL-1、0.0020 mg·mL-1、0.0501 mg·mL-1、0.0051 mg·mL-1的混合對照品溶液。

供試品溶液制備 取本品3號篩粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.1 線性關(guān)系考察

將混合對照品溶液分別進(jìn)樣3、5、7、10、15 μl檢測，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分的回歸方程。結(jié)果見表2。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取同一混合對照品溶液，分別在同一天連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行日內(nèi)精密度試驗(yàn)，計(jì)算各成分峰面積的RSD，考察儀器的日內(nèi)精密度。結(jié)果顯示，各成分峰面積的RSD＜2.0%，說明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批藥材，制備供試品溶液6份進(jìn)樣分析，測定各成分峰面積，計(jì)算含量，考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，各成分含量的RSD均＜3.0%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣檢測，測定各成分峰面積，計(jì)算含量，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各成分含量RSD均＜2.0%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取本品粉末6份，每份0.25 g，分別精密添加沒食子酸0.3048 mg、兒茶素0.1454 mg、氧化芍藥苷1.133 mg、芍藥苷1.9980 mg、苯甲酸0.1400 mg、丹皮酚5.594 mg、苯甲酰芍藥苷0.4711 mg，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見（表3）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同采收月份牡丹皮物質(zhì)積累動態(tài)

對不同生長期的牡丹皮測定生長量，結(jié)合每畝種植牡丹皮約3000～5000株，以4000株計(jì)算牡丹皮的產(chǎn)量，畝產(chǎn)量（kg）=30株藥材干重*4000/30（表4）。

從表4可以看出，9月-10月，牡丹根部干物質(zhì)積累量達(dá)到最高峰，平均為4.587 kg·30株-1，說明在這期間牡丹皮的畝產(chǎn)量較大。5月-6月，雖然牡丹皮的產(chǎn)量也較高，但此期正值牡丹皮生長與生殖最旺盛期，光合作用強(qiáng)，且春夏季節(jié)多雨，藥材不易干燥，不適宜采挖；而在8-10月期間牡丹的地上部分剛枯萎，光合作用能力隨時間延遲而逐漸下降，干物質(zhì)積累較多，此時牡丹皮的折干率較高，畝產(chǎn)量較大且采挖的牡丹皮根條飽滿，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，粉性足。因此，從經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)量綜合考慮，牡丹皮采收期應(yīng)在8-10月。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同采收月份牡丹皮物質(zhì)的積累情況（kg·30株-1）

表5 牡丹皮不同采收月份各項(xiàng)指標(biāo)成分結(jié)果（n=3）

3.2 不同采收月份牡丹皮各項(xiàng)指標(biāo)成分測定

取牡丹皮樣品，分別測定各項(xiàng)指標(biāo)成分(表5，圖3，圖4)。

牡丹皮7成分含量總和以5月、8月份為最高，8月-9月下旬期間含量呈小幅度下降，相對比較穩(wěn)定，之后至12月份各成分含量下降明顯（圖3）；浸出物含量在3月-6月期間，隨月份的增加浸出物含量下降幅度較大（圖4）。6月-10月期間，浸出物含量變化幅度較小，基本保持穩(wěn)定，11月份含量開始回升。結(jié)合產(chǎn)量、有效成分分析，牡丹皮采收應(yīng)選擇在8-10月份。

3.3 不同生長年限牡丹皮物質(zhì)積累動態(tài)（表6，表7）

2年生牡丹皮的干物質(zhì)增加較快，較1年生牡丹皮干重增加了138.6%，4年生、5年生、6年牡丹皮干重比前一年的增加率均在10%以上，7年生牡丹皮干重比前一年的增加率僅為0.4%，與6年比較畝產(chǎn)量增加不多。1-2年生牡丹植株矮小，根少、細(xì)，不宜采收藥材；3年生牡丹主根可加工成藥材，但質(zhì)量明顯較次；4年生牡丹質(zhì)量雖好，但產(chǎn)量相對不高，經(jīng)濟(jì)效益較差；5-6年生牡丹皮加工藥材質(zhì)量較好，在藥材表面和縱裂縫處肉眼可見丹皮酚結(jié)晶，且產(chǎn)量較高，但7年生牡丹皮藥材粉性開始降低，容易受到病蟲的侵害而腐爛，肉眼可見藥材表面的黑色凹狀不規(guī)則疤痕，藥材質(zhì)量較差，且隨著生長年限的延長，藥材的木心率也增大。

3.4 不同生長年限牡丹皮各項(xiàng)指標(biāo)成分測定

取不同年限牡丹皮樣品，分別測定各項(xiàng)指標(biāo)成分(表8，圖5，6)。

由圖5可以看出，栽后生長5年-6年期間的牡丹皮中各成分含量呈積累趨勢，其中以6年生牡丹皮中各成分含量總和最高（圖5）；浸出物以栽后生長5年-6年期間的牡丹皮中浸出物含量較高（圖6）。綜合產(chǎn)量、有效成分分析，牡丹皮的適宜采收期應(yīng)在移栽5-6年采收。

圖3 不同采收月份的牡丹皮7成分含量累積

圖4 不同采收月份的牡丹皮浸出物

表6 不同生長年限牡丹皮比較

表7 不同生長年限牡丹植株生長情況（kg·30株-1）

3.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析

3.5.1 樣品數(shù)據(jù)集建立

本文以不同月份和不同年限的7種成分為指標(biāo)性成分，建立牡丹皮質(zhì)量灰色模式識別數(shù)據(jù)集（表5，表8）。

3.5.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理

設(shè)有n個研究樣品，每個樣品有m項(xiàng)評價指標(biāo)，則組成評價單元序列，記為{Xik}(i=1,2,3,…,n;k=1,2,3,…,m;本研究中n=8,m=8)。由于評價指標(biāo)之間存在測試單位不統(tǒng)一的問題，需對其進(jìn)行變換處理。以均值化變換最為常用，見公式（1）。各指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)經(jīng)規(guī)格化處理后可用于關(guān)聯(lián)度計(jì)算，結(jié)果見表9。

式中Yik為規(guī)格化處理后數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為第n個藥材樣品的第k個指標(biāo)的均值。

3.5.3 關(guān)聯(lián)度計(jì)算

用灰色關(guān)聯(lián)度作為評價測度時，應(yīng)選擇參考序列，一般應(yīng)確定最優(yōu)參考序列和最差參考序列。將最優(yōu)參考序列的各項(xiàng)指標(biāo)對應(yīng)n個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最大值，記為{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}，最差參考序列的各項(xiàng)指標(biāo)對應(yīng)n個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最小值，記為{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。分別按公式（2）和公式（3）計(jì)算相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。按公式（4）和公式（5）計(jì)算各評價單元相對于最優(yōu)（差）參考序列的關(guān)聯(lián)度；按公式（6）計(jì)算各樣品的相對關(guān)聯(lián)度，并按ri大小排序（表10）。

表8 不同年份牡丹皮考察結(jié)果（n=3）

圖5 不同生長年限的牡丹皮7成分含量累積

最優(yōu)參考序列，關(guān)聯(lián)系數(shù)：

式 中 ，Δmin=min|Yik—Ysk|,Δmax=max|Yik—Ysk|(i=1,2,3,…n,k=1,2,3,…m)

最差參考序列，關(guān)聯(lián)系數(shù)：

式中，Δ′min=min|Yik—Ytk|，Δ′max=max|Yik—Ytk|,(i=1,2,3,……n，k=1,2,3,……m，ρ為分辨系數(shù)，一般取值0.5。）

圖6 不同生長年限的牡丹皮浸出物

相對關(guān)聯(lián)度ri越大，表明牡丹皮藥材的綜合質(zhì)量評價越高，ri排序結(jié)果可作為藥材質(zhì)量高低評價的依據(jù)。由表10可知，在牡丹皮不同采收年限樣品中，以相對關(guān)聯(lián)度的大小排序，從大到小的順序?yàn)椋?年＞5年＞7年＞2年＞1年＞3年＞4年，分析種植5-6年采收的牡丹皮綜合質(zhì)量較佳。在不同月份樣品中，有兩個時間段分別是3-4月和8-9月的牡丹皮綜合質(zhì)量較好，由于3-4月正值生長期，另外結(jié)合畝產(chǎn)量考慮，3-4月份的畝產(chǎn)量較低，而8-10月份的畝產(chǎn)量較大，所以綜合有效成分質(zhì)量和畝產(chǎn)量考慮，亳州地區(qū)的牡丹皮最佳采收期為移栽5-6年的8-10月采收。

4 總結(jié)

傳統(tǒng)的丹皮采收季節(jié)為農(nóng)歷二、八月，即初春和晚秋。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同采收季節(jié)的牡丹皮的丹皮酚、芍藥苷、沒食子酸等含量存在差異。兒茶素、氧化芍藥苷含量隨月份變化不顯著；丹皮酚、沒食子酸含量含量隨月份變化明顯，在5月、9月達(dá)到最高峰；芍藥苷、苯甲酰芍藥苷含量以3月份含量最高，8-12月之間含量較穩(wěn)定；苯甲酸含量隨月份變化呈波動式變化，6月-10月含量相對較高。7成分含量總和其隨月份的變化規(guī)律與丹皮酚含量變化規(guī)律基本一致，以5月、8月份的含量總和最高，8月-9月下旬期間含量呈小幅度下降，相對較穩(wěn)定。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，牡丹皮中所含的丹皮酚成分的累積在一年內(nèi)有兩個高峰（5-6月和9-10月）[11]，但5-6月正值牡丹皮生長與生殖最旺盛期，光合作用強(qiáng)，且春夏季節(jié)多雨，藥材不易干燥，不適宜采挖。8月-10月份地上枝葉變黃，在這期間牡丹皮的枝葉已枯萎，光合作用能力隨時間延遲而逐漸下降，根部的干物質(zhì)積累較多，根部貯存了大量的養(yǎng)分，此時采收的藥材形體飽滿、粉性足，質(zhì)量和產(chǎn)量均高，采收的根皮藥用價值最高。因此，綜合藥效成分含量特別是指標(biāo)性物質(zhì)（丹皮酚）積累量、種植成本、土地利用率、產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益等因素考慮，亳州地區(qū)牡丹皮應(yīng)在8月-10月的晴天采收，這與牡丹皮藥材傳統(tǒng)采收習(xí)慣一般以種植3-5年后在秋季采收為宜相符[12]。

表9 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理

表10 牡丹皮不同采收期樣品相對關(guān)聯(lián)度及綜合排序

關(guān)于牡丹皮的種植年限，一般4-6年不等[13-16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著生長年限的延長，牡丹皮的產(chǎn)量會不斷增加。但7年生牡丹皮藥材粉性開始降低，容易受到病蟲的侵害而腐爛，部分根生病死亡。而且牡丹皮的主要有效成分含量只在一定年限區(qū)間內(nèi)呈累積趨勢，5-6年較高，6年之后含量下降。因此，亳州牡丹皮的適宜采收年限為5-6年，以6年采收最佳。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法在中藥質(zhì)量評價中的應(yīng)用主要是基于中藥樣本各指標(biāo)成分定量數(shù)據(jù)，建立灰色關(guān)聯(lián)度評價模型，計(jì)算評價單元序列與參考序列間的相對關(guān)聯(lián)度，對評價單元進(jìn)行排序，從而獲得評價結(jié)果[17,18]。本文從多方面研究并采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法綜合評價不同采收期的牡丹皮質(zhì)量情況，為亳州產(chǎn)區(qū)的牡丹皮的最佳采收期提供一定的參考依據(jù)。