HPLC法測定蔬菜中3種喹諾酮類抗生素

羅 潔，羅 可，鄒小翠，彭敏婕，阮曉玲

（長沙醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410219）

0 引言

喹諾酮類抗生素（QNs）作為抗菌藥物被廣泛用于人和動物感染性治療中[1-2]。喹諾酮類抗生素使用后多以藥物原型或代謝產(chǎn)物隨尿糞排出，由于難以降解，成為有機(jī)環(huán)境污染物[3]，污染了水域[4-5]和土壤環(huán)境[6-7]，特別是在動物類食品中抗生素殘留污染問題尤為嚴(yán)重，且已經(jīng)得到了社會的廣泛關(guān)注[8]。我國限定動物類食品中喹諾酮類抗生素（環(huán)丙沙星和恩諾沙星)最高殘留標(biāo)準(zhǔn)為（100 μg/kg）[9]。諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）和恩諾沙星（ENR）是近年來較常見的3種人畜共用的QNs類抗生素，對該類抗生素在動物類食品中殘留的分析方法研究較多[10-11]，而在蔬菜中殘留的分析方法鮮有報道[12-13]。針對蔬菜中這3種喹諾酮類抗生素的檢測建立了較快捷、簡便的高效液相色譜（HPLC）分析方法，并采用該方法對市售蔬菜中此類抗生素污染及其對人體健康風(fēng)險問題進(jìn)行了探討，以期為蔬菜中喹諾酮類抗生素的檢測分析和健康風(fēng)險評價提供更可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

LC-20A型高效液相色譜儀，島津公司產(chǎn)品；C18色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品；BSA124S型分析天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司產(chǎn)品；AS系列超聲儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；ZWB-LS1-40型超純水機(jī)，湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰井a(chǎn)品。

諾氟沙星對照品（純度均>98%，批號D1712037）、恩諾沙星對照品（純度均>98%，批號C1731069）、環(huán)丙沙星對照品（純度均>98%，批號C1703096），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙腈（HPLC），天津康科德科技有限公司提供；磷酸（AR）、乙酸（AR），天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司提供；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

2 色譜條件

色譜柱為HederaODS-2 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈：0.1%甲酸水溶液（20∶80 V/V），流速1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣體積20 μL。

3 溶液的配制

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星對照品約5 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，加入少量流動相配比溶液后超聲處理10 min助溶，流動相溶液定容，得質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的對照品儲備液；分別精密移取1 mL上述3種對照品溶液置于20 mL棕色容量瓶中，用流動相溶液定容至刻度，即得質(zhì)量濃度0.01 mg/mL的混合對照儲備液于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 樣品前處理

用清水洗滌蔬菜樣本，再用實(shí)驗(yàn)室自制超純水反復(fù)清洗3次，晾干后研磨粉碎。精密稱取約5 g置于燒杯中，加入20 mL提取液（乙酸∶乙腈4∶96，V/V），保鮮膜密封燒杯口，置于超聲儀中超聲提取15 min，取出靜置冷卻15 min，過濾，濾液置于蒸發(fā)皿中于90℃下蒸干，移取2 mL流動相溶液復(fù)溶，過0.45 μm微孔濾膜過濾，置于EP管中備用。

4 方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 專屬性試驗(yàn)

取混合對照溶液和油麥菜樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀中，在上述色譜條件下進(jìn)行測定。諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的保留時間分別為6.23，6.96，9.51 min，3種成分峰形較好、分離度良好。

3種抗生素對照品HPLC圖見圖1，油麥菜空白對照的HPLC圖見圖2。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限和最低檢測限

取10 g/mL混合對照溶液儲備液用空白蔬菜汁（上述前處理得到）與流動相的混合溶液稀釋，得到0.2，0.6，1.0，4.0，8.0，10.0 g/mL系列質(zhì)量濃度混合對照液，分別取20 μL進(jìn)行HPLC分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以倍噪比（S/N=3）為最低檢測限LOD，以倍噪比（S/N=10）為定量限LOQ。

3種抗生素的線性關(guān)系、檢測限和定量限見表1。

圖1 3種抗生素對照品HPLC圖

圖2 油麥菜空白對照的HPLC圖

表1 3種抗生素的線性關(guān)系、檢測限和定量限

在0.3～10.0 g/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，3種喹諾酮類抗生素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；3種喹諾酮類化合物的檢出限為60～120 g/kg，定量限為180～360 g/kg。

4.3 精密度試驗(yàn)

取已配置好的混合對照儲備液在上述條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣20 μL，測得諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的峰面積RSD值分別為0.47%，0.37%，0.39%，表明儀器精密度良好。

4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取已配置好的混合對照儲備液，按設(shè)定的色譜條件，分別于質(zhì)量濃度0，0.5，1.5，3.0，5.0，8.0，10.0 g/mL進(jìn)樣分析，測得3種成分的峰面積RSD值分別為1.39%，1.34%，1.70%，說明3種喹諾酮化合物在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.5 加樣回收率試驗(yàn)

取“3.2”中的供試品勻漿5 g置于25 mL棕色容量瓶中，平行3份，加入標(biāo)準(zhǔn)限度100 μg/kg的喹諾酮抗生素對照品，分別進(jìn)樣測定分析，計算回收率，得到各成分的加標(biāo)回收率均在92%～94%，且RSD值均≤3%，證明該方法的回收率較好。

3種抗生素的加樣回收率試驗(yàn)（n=3）見表2。

表2 3種抗生素的加樣回收率試驗(yàn)（n=3）

4.6 不同種類蔬菜的回收率

不同品種蔬菜中的葉綠素、蛋白質(zhì)、植物脂肪等物質(zhì)的含量分布會對喹諾酮類抗生素的提取、凈化等效果造成一定影響。試驗(yàn)僅對生菜、茼蒿和油麥菜中3種QNs類抗生素的加標(biāo)（100 μg/kg）回收率進(jìn)行檢測。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中CIP的回收率均在80%左右，ENR在62%～65%，NOR均在70%以上。因此，該方法能夠適用于不同品種蔬菜中喹諾酮類抗生素分析檢測的要求。

5 實(shí)際樣品質(zhì)量濃度測定

購買市場上3種不同蔬菜樣品，按照上述的樣品制備方法進(jìn)行前處理后，在設(shè)定的色譜條件下測定蔬菜中3種喹諾酮類抗生素的質(zhì)量濃度。

蔬菜中3種QNs類抗生素質(zhì)量濃度測定結(jié)果見表3。

表3 蔬菜中3種QNs類抗生素質(zhì)量濃度測定結(jié)果

在油麥菜未檢測出3種成分，在生菜及茼蒿中檢測到了一定量的環(huán)丙沙星和諾氟沙星，質(zhì)量濃度在0.1～0.5 μg/mL，均超出了我國動物性食品中的最高殘留限量（100 μg/kg），由此可看出，蔬菜中的確含有該類喹諾酮類抗生素，且對人類健康存在隱患。所以，蔬菜等食品中QNs類抗生素的富集情況應(yīng)該得以重視。

6 結(jié)果與分析

6.1 樣品前處理條件的選擇

6.1.1 提取液的選擇

對蔬菜（大白菜）樣品（5.0 g）以20 mL不同配比的提取液進(jìn)行提取，繪制得到3種QNs類抗生素的加樣回收率。

提取液種類對喹諾酮類抗生素回收率的影響見圖3。

圖3 提取液種類對喹諾酮類抗生素回收率的影響

由圖3可知，3種不同配比的提取液對蔬菜中3種QNs類抗生素的加樣回收率均大于70%，其中提取液a對恩諾沙星和諾氟沙星的回收率差異不大，但這3種提取液中，提取液a對環(huán)丙沙星的回收率是最高的，且回收率在80%以上。因此選擇提取液a用于提取蔬菜樣品中的QNs類抗生素。

6.1.2 提取時間的選擇

提取時間往往直接決定提取液與固體顆粒的接觸面積和接觸程度，接觸面積愈大且接觸程度越好，則提取效率愈高。但試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取時間超過15 min后，提取時間對提取效果的影響并不大。所以，選擇15 min作為提取時間。

提取時間對喹諾酮類抗生素回收率的影響見圖4。

圖4 提取時間對喹諾酮類抗生素回收率的影響

6.2 流動相的選擇

喹諾酮類抗生素的流動相的pH值與解離狀態(tài)。在強(qiáng)酸介質(zhì)（pH值＜3）中，QNs類抗生素為強(qiáng)陽離子；當(dāng)pH值為3～4時，QNs類抗生素則呈兩性離子形式；但當(dāng)pH值為中性時，QNs類抗生素又表現(xiàn)為弱陰離子；且在堿性條件下，QNs類抗生素為陰離子形式。所以，流動相的pH值對QNs類抗生素在色譜柱上的保留時間和分離度有較明顯的影響，試驗(yàn)表明流動相中加一定酸性溶液，這3種QNs類抗生素的峰形會得到改善。所以，選擇以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，并使用等度洗脫方式來實(shí)現(xiàn)3種QNs類化合物的良好分離。