響應(yīng)面法優(yōu)化霍山石斛三萜皂苷提取工藝研究

陳乃東，王 成，陳乃富，陳存武，韓邦興，戴 軍，程 浩

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，安徽 霍山 237266)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanneseTang et Cheng)，俗稱米斛，為蘭科石斛屬多年生草本植物[1](P75)，主產(chǎn)于安徽霍山等地，含有三萜皂苷、甾體皂苷及醛類等成分[2]，具有生津益胃、明目強(qiáng)身、抗腫瘤、抗衰老、擴(kuò)張血管等功效[3-6]，是安徽道地藥材之一。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三萜皂苷具有顯著的抗炎、抗病毒、抗衰老、防治心腦血管疾病等藥理活性[7]，截至目前尚無霍山石斛中三萜皂苷提取及含量測定研究的報道。有鑒于此，本研究首先采用Box-Benkhen設(shè)計優(yōu)化獲得霍山石斛中總?cè)圃碥盏奶崛l件，采用最佳提取工藝條件，對其根莖葉中總?cè)圃碥盏暮窟M(jìn)行對比研究。研究結(jié)果可望為霍山石斛藥材的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料霍山石斛2018年11月采自霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司太平畈石斛基地，品種經(jīng)皖西學(xué)院陳乃東教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshaneseTang et Cheng)。霍山石斛新鮮全株，洗凈，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎，過40目篩，備用。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，批號508-02-1，aladin公司)；香草醛(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；冰醋酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)；無水碳酸鈉(分析純，天津市北辰方正試劑廠)。

FA-1004型號電子天平(上海精科天平廠)；HR/T20MN型立式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；TU-1901型雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)齊墩果酸甲醇溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL分別放入10個刻度試管中，于75 ℃水浴中揮去甲醇，加入新配制的濃度為5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻；60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻數(shù)分鐘，搖勻，加入4.0 mL乙酸乙酯稀釋，以不加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平行樣為空白，在554 nm處測定吸光值(A)[8]。以標(biāo)準(zhǔn)齊墩果酸甲醇溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A= 28.309C-0.03(R2=0.9909)，結(jié)果表明齊墩果酸濃度在2～24 ug/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 總?cè)圃碥盏奶崛?/p>

精密稱取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉，一定濃度的甲醇冷凝回流提取過濾獲總?cè)圃碥仗崛∫骸?/p>

1.2.3 總?cè)圃碥蘸康臏y定

精密吸取0.2 mL按“1.2.2”方法制備的提取液，按1.2.1所述步驟操作，在554 nm處測定吸光值(A)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算霍山石斛中三萜皂苷的提取得率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

精密稱取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉若干份，按表1的設(shè)計進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，依次考察甲醇濃度、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度、液料比對霍山石斛三萜皂苷提取得率的影響，當(dāng)考察其中一個因素時，其他因素均取表1所述的第3水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個重復(fù)。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計表

1.2.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇以溶劑濃度(A)、提取次數(shù)(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)、液料比(E)作為相應(yīng)變量，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，編碼水平為-1，0和1，且分別以三萜皂苷提取得率(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計5因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

使用軟件Design Expert 10.0對響應(yīng)面法設(shè)計實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，確定霍山石斛三萜皂苷的最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 甲醇濃度對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐实挠绊?/p>

由圖1-1可知，當(dāng)甲醇濃度在0%～75%變化時，三萜皂苷的提取得率逐漸增加，當(dāng)甲醇濃度為75%時，三萜皂苷提取得率達(dá)到最大，之后甲醇濃度的增加，三萜提取得率反而下降，可能是因?yàn)榧状紳舛鹊脑黾?，使雜質(zhì)的溶出加大，阻礙的三萜皂苷的溶出，因此，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇濃度0%～50%作為優(yōu)化提取范圍。

2.1.2 提取次數(shù)對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐实挠绊?/p>

從圖1-2可知，當(dāng)提取次數(shù)在1～3次變化，三萜皂苷提取得率顯著增加；當(dāng)提取次數(shù)大于3次時隨著提取次數(shù)增加，三萜皂苷提取得率的變化趨于平緩，繼續(xù)增加提取次數(shù)的意義不大，因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取次數(shù)為2～4次作為優(yōu)化提取范圍。

2.1.3 提取時間對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐实挠绊?/p>

從圖1-3可知，當(dāng)提取時間在0.5～2 h變化，三萜皂苷提取得率增長迅速；當(dāng)提取次數(shù)為2～4 h時，三萜皂苷提取得率的變化趨于平緩，提取時間較短時，提取可能不充分，因此提取得率較低，隨著提取時間的增加，三萜皂苷的溶出已達(dá)限度，因此，從提高效率的角度考慮，實(shí)驗(yàn)選擇提取時間為0.5～2 h作為優(yōu)化提取范圍。

2.1.4 提取溫度對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐实挠绊?/p>

從圖1-4可知 ，當(dāng)提取溫度在20～80 ℃變化，三萜皂苷提取得率逐漸增加 ；溫度越高，提取得率越大，但80 ℃以后，隨著提取溫度的增加，可能會有部分三萜皂苷因高溫而分解，因此，實(shí)驗(yàn)選擇提取時間為40～80 ℃作為優(yōu)化提取范圍。

2.1.5 液料比對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐实挠绊?/p>

從圖1-5可知，當(dāng)液料比在10∶1～50∶1變化時，三萜皂苷提取得率逐漸增加，當(dāng)液料比較小時，溶劑較少，因此，提取得率較小，隨著溶劑增加，溶劑與物料接觸很充分，但物料中三萜皂苷的溶出會達(dá)到上限，因此，實(shí)驗(yàn)選擇液料比20∶1～40∶1作為最佳優(yōu)化提取范圍。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 模型建立與顯著性考察

采取Design-Expert 10.0.4軟件對單因素實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表3為通過軟件分析之后得到的對霍山石斛提取的五因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計及各實(shí)驗(yàn)條件下的霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉寐省?/p>

2.2.2 響應(yīng)面分析

依據(jù)表4的結(jié)果，利用Design-Expert 10.0.4進(jìn)行回歸分析，得到霍山石斛三萜(Y)與甲醇濃度(A)、次數(shù)(B)、時間(C)、溫度(D)、液料比(E)多元非線性回歸方程：

利用Design-Expert 10.0.4軟件，將46個試驗(yàn)點(diǎn)的總?cè)圃碥仗崛〉寐瘦斎?，得到霍山石斛總?cè)圃碥仗崛∽罴压に嚄l件為甲醇濃度35%，次數(shù)4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1。

表3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

從表4回歸模型的方差分析顯著性檢驗(yàn)看，因素的一次項(xiàng)(A、B、C、D、E)，因素的二次交互項(xiàng)(CD、BE)，二次項(xiàng) (A2、B2、C2、D2E2)，對三萜皂苷提取得率的影響是顯著的(P<0.05)，其余一次項(xiàng)和二次項(xiàng)交互項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著(P>0.05)。 在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計范圍內(nèi)，該模型的P值為0.0001；說明模型的回歸極顯著；模型的相關(guān)系數(shù)為0.9614，說明該模型能解釋96.14%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化霍山石斛三萜皂苷的提取工藝是可行的。

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

注：*p<0.05，差異顯著；**p<0.01，差異極顯著。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析圖

為了更直觀地表現(xiàn)對提取得率的影響較為顯著的二次交互項(xiàng)CD、BE的對霍山石斛總?cè)圃碥仗崛〉挠绊?，繪制兩因素交互作用的響應(yīng)面圖(圖2、圖3)，可見，甲醇濃度(E)與時間(B)，次數(shù)(D)與溫度(C)的交互作用對三萜皂苷的提取得率的影響是顯著的。

圖2 甲醇濃度和時間對總?cè)圃碥仗崛〉寐视绊懙捻憫?yīng)面

圖3 次數(shù)和溫度對總?cè)圃碥仗崛〉寐视绊懙捻憫?yīng)面

圖2為其他因素在一定水平，固定時間不變時，三萜皂苷的提取得率隨著甲醇濃度的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢；當(dāng)甲醇濃度較大時，三萜皂苷的提取得率隨著時間的增加呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢，甲醇濃度較低時，三萜皂苷的提取得率隨著時間的增加快速增加，達(dá)到一定值后趨于平緩。從響應(yīng)面可看出甲醇濃度的上升幅度比時間陡峭，因而甲醇濃度對三萜皂苷的提取得率影響大于時間。

圖3為其他因素在一定水平，固定溫度不變時，三萜皂苷的提取得率隨著提取次數(shù)的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢；當(dāng)提取次數(shù)較少時，三萜皂苷的提取得率隨著溫度的增加呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢，提取次數(shù)較多時，三萜皂苷的提取得率隨著溫度的增加緩慢增加，達(dá)到一定值后趨于平緩。從響應(yīng)面可看出次數(shù)的上升幅度比溫度陡峭，因而次數(shù)對三萜皂苷的提取得率影響大于溫度。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了對最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，在甲醇濃度35%，次數(shù)4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1的條件下進(jìn)行三組平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終得到的霍山石斛三萜皂苷的提取得率為3.04%，與預(yù)測值差異較小。因此該工藝參數(shù)可用來指導(dǎo)霍山石斛三萜皂苷的提取。

2.5 霍山石斛根莖葉總?cè)圃碥蘸繙y定

在最佳提取條件下提取條件下對霍山石斛的根，莖，葉分別提取，測定其總?cè)圃碥盏暮?，最終的到三萜皂苷的提取得率分別為3.46%、0.85%、2.47%，通過測定發(fā)現(xiàn)霍山石斛葉中三萜含量高于根和莖，此結(jié)論對霍山石斛中甾體皂苷的工業(yè)化制備提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化法，對提取次數(shù)、甲醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度這五個因素進(jìn)行考察，并采用Design-Expert 10.0.4軟件進(jìn)行分析，通過二次回歸方程，得到的最優(yōu)提取工藝為甲醇濃度35%，次數(shù)4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1，在此條件下，霍山石斛三萜皂苷的提取得率為3.04%。

霍山石斛的傳統(tǒng)用藥方式以莖入藥，在采收中，根和葉作為廢棄物直接丟棄，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，霍山石斛根和葉中總?cè)圃碥盏暮糠謩e為3.16%和2.47%，中明顯高于莖中的0.85%，該結(jié)果可為霍山石斛資源綜合利用提供參考依據(jù)。