高通量測序結(jié)合傳統(tǒng)方法分析4 ℃下鮮切菠菜的菌群變化

郁杰，謝晶

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷庫及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(上海)，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海，201306) 4(上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心，上海，201306)

鮮切凈菜是以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)過分揀、清洗、切分、包裝等一系列處理后制成的即用或即食的蔬菜制品，在行業(yè)內(nèi)也被稱為“最小加工(minimally processed)”產(chǎn)品，具有新鮮、便捷、營養(yǎng)等優(yōu)點。近年來，我國鮮切蔬菜的消費市場正逐年擴(kuò)大，但鮮切蔬菜本身含水量較高，又經(jīng)過切割等程序，導(dǎo)致汁液流失嚴(yán)重，這些受傷的組織為微生物提供營養(yǎng)，使多種微生物群落得以繁殖，導(dǎo)致腐敗，這直接限制了產(chǎn)品流通和貨架期。腐敗菌對鮮切蔬菜產(chǎn)生破壞的癥狀主要體現(xiàn)在褐變、產(chǎn)生異味、結(jié)構(gòu)喪失以及在較低程度上的軟腐，這極大地影響到消費者的購買欲望，國外已有學(xué)者指出：在鮮切蔬菜的貯藏過程中，腸桿菌、假單胞菌以及乳酸菌等腐敗菌的增長與酸味、褐變、軟腐有強(qiáng)相關(guān)性[1-2]。目前對鮮切葉菜微生物的研究主要集中在保鮮技術(shù)、清洗方式以及致病菌等領(lǐng)域，對鮮切葉菜中特定腐敗菌的研究較少[3-4]。

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是一種綠葉蔬菜，人們常常將其鮮切后置于4 ℃下售賣[5]。鮮切菠菜在貯藏過程中易受微生物的侵襲導(dǎo)致腐敗[6]。本研究借助高通量測序技術(shù)[7-9]，結(jié)合傳統(tǒng)檢測，全面地研究鮮切菠菜在0、4、8 d主要腐敗菌及其演替規(guī)律，解析腐敗菌的組成、生理生化特性、豐度及多樣性，以此為指導(dǎo)企業(yè)防腐殺菌、產(chǎn)品貯運等工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菠菜的鮮切處理及分組

菠菜：要求大小均一、色澤鮮綠、清潔、無明顯缺陷、無病蟲毒害。大棚種植，于6月份采摘，采摘時間為上午5時，溫度約25 ℃，濕度約70%RH，采后立即配送至實驗室。經(jīng)去離子水清洗后，將樣品用已滅菌的不銹鋼菜刀距菠菜根部約3 cm處進(jìn)行鮮切，并在無菌條件下將鮮切菠菜隨機(jī)分為3大組，每大組分為3小組，每小組分裝80 g/盒，放入無菌塑料盒，并用透明保鮮袋包好，置于4 ℃下貯藏備用。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 實驗試劑

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基(CFC)、腸桿菌科瓊脂培養(yǎng)基(VRBDA)、葡萄球菌瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、梭菌鑒別瓊脂(DRCA)：青島海博生物技術(shù)有限公司；微生物生理生化微量鑒定管：青島海博生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit：M5635-02，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：Q10212，Life；2×TaqMaster Mix：P111-03，Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：EC401-03，Transgen。

1.2.2 實驗儀器

高速冷凍離心機(jī)(H-2050R-1型)，長沙湘儀離心機(jī)有限公司；高溫高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hi-rayama制造有限公司；PCR儀(T100TM)Thermal Cyeler，BIO-RAD；超凈工作臺(VS-1300L-U)，上?？蹈Ｌ丨h(huán)境科技有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床(KYC-100C)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；電泳儀(DYY-6C、DYCZ-21型)，北京市六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官評定

挑選8名經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行感官評定，每人每次評定設(shè)為3次。標(biāo)準(zhǔn)參照PAILLART等[10]方法，感官評估分為3步進(jìn)行：①評估葉條的整體顏色及表觀，②對消費者的接受度進(jìn)行打分，③將葉片平鋪在白色背景下觀察葉片萎焉程度。以上指標(biāo)評定后分?jǐn)?shù)越高代表品質(zhì)越好，每項評定滿分為10分，每天評定1次。

1.3.2 腐敗菌的分離純化

(1)在無菌條件下隨機(jī)準(zhǔn)確稱取樣品10 g，剪碎并混勻，放入90 mL無菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為8.5 g/L) 中，充分搖勻之后用1 mL移液槍加入含有9 mL的生理鹽水試管中進(jìn)行10倍遞增稀釋，稀釋成所需濃度，選取合適的稀釋濃度，吸取1 mL上述菌懸液，置于表1各個培養(yǎng)基中。

(2)經(jīng)培養(yǎng)后，從各種培養(yǎng)基中挑取典型生長的、形態(tài)不同的菌落，平板劃線法反復(fù)分離、純化3次，直至菌落的生長狀態(tài)和形態(tài)特征表現(xiàn)一致時得到純的菌落，純菌落斜面接種，培養(yǎng)后于4 ℃保存。

(3)每隔1 d進(jìn)行上述工作，培養(yǎng)條件見表1。

表1 各種微生物菌相的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of various microorganisms

1.3.3 菌懸液的制備及保種

用接種環(huán)依次挑取經(jīng)過上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)帶有明顯特征的菌落，標(biāo)號見表1，分別接種至裝有5 mL滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管內(nèi)，盡量保證所有數(shù)據(jù)采集完整，搖床37 ℃、160 r/min振蕩過夜。待菌懸液制備后，用移液槍從每支試管內(nèi)吸取0.1 mL菌液，垂直滴落在已凝固的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布，靜置10 min左右，于37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行保種，待單菌落生成后，置于4 ℃冰箱保藏備用，菌懸液置于冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 菌種的初步鑒定及計數(shù)

(1)初步鏡檢：將已獲得純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并用顯微鏡油鏡觀察細(xì)胞個體形態(tài)、排列等，每一處理均設(shè)3次重復(fù)，挑選最典型的菌落觀察。

(2)生理生化鑒定：參照崔慧玲等[11]對鮮切菜品的鑒定圖譜，使用相應(yīng)的微生物生理生化微量鑒定管鑒定后，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，各項生理生化試驗每一處理均設(shè)3次重復(fù)，避免假陽性的發(fā)生。

(3)選取菌落總數(shù)在30～300 CFU范圍內(nèi)的平皿，菌落計數(shù)參考GB 4789.2—2016[12]中的平板計數(shù)法測定，用PCA培養(yǎng)基測定總菌數(shù)量。在以上鑒定的基礎(chǔ)上，用選擇性培養(yǎng)基CFC、VRBDA、MSA、DRCA根據(jù)已觀察形態(tài)及生理生化的結(jié)論初步測定假單胞菌、腸桿菌、微球菌、梭菌的菌落數(shù)得出在0、4、8 d的大致比例。

1.3.5 總DNA的提取

參照NIEMINEN等[13]的方法在無菌超凈工作臺中，隨機(jī)從不同袋子中選取不同部位的菠菜葉片，保證采集樣品的代表性，共稱取10 g菠菜葉片，置于無菌均質(zhì)袋中，加入90 mL的無菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為8.5 g/L)，劇烈振蕩1 min，取出樣品，靜置10 min后，在10 000 r/min下離心10 min，棄上清，取10 mL沉淀，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩ｋS后按照OMEGA試劑盒的方法操作，提取細(xì)菌總DNA，并用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.6 16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增及Illumina雙末端測序

在肖英平等[14]實驗方法的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，以上述提取的總細(xì)菌基因組DNA為模板，引物針對16S rRNA基因V3～V4區(qū)合成特異引物，利用341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后測序，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol，將檢測后合格的樣品委托上海生工生物工程有限公司。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

參照儲建軍等[15]方法進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控及過濾,包括：去除引物接頭序列、序列拼接、質(zhì)量剪切、去除非擴(kuò)增區(qū)域序列和嵌合體序列，隨后進(jìn)行blastn比對，在97%的相似水平下進(jìn)行歸類,得到分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，以此得出每個OTU分類學(xué)信息。隨后以隨機(jī)抽到的序列數(shù)與香農(nóng)指數(shù)(Shannon)構(gòu)制稀釋度曲線曲線，評估樣品測序數(shù)據(jù)量的合理性。再者，基于得到的OTUs計算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、菌種豐富度指數(shù)(Chao1)、辛普森指數(shù)(Simpson)、覆蓋率(Coverage)和ACE等常用的Alpha生物多樣性指數(shù)，衡量樣本中物種的多樣性[16]，并且通過貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，在科、屬水平上進(jìn)行群落豐度統(tǒng)計分析并作圖，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成，鑒定優(yōu)勢腐敗菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定及總菌

圖1及圖2分別顯示了4 ℃下貯藏的鮮切菠菜感官評分、總菌及表觀變化。由圖可知，隨著貯藏時間的增加，鮮切菠菜的感官評價呈下降趨勢，在第8天，其感官評分降至5分以下，變得不可接受，葉片出現(xiàn)大面積萎蔫、發(fā)黃并出現(xiàn)不同程度的軟腐，鮮切

部位出現(xiàn)褐變，打開包裝可明顯感受到腐臭味；而總菌含量隨著貯藏時間的增長而增長，在第8天時，超過6 lg CFU/g，兩者指標(biāo)具有相關(guān)性，在第8天，感官和總菌含量皆超出標(biāo)準(zhǔn)，說明已失去商品價值[17]。

圖1 4 ℃下冷藏對鮮切菠菜感官品質(zhì)和菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of cold storage at 4 ℃ on sensory quality and colony count of fresh cut spinach

圖2 4 ℃冷藏條件下不同貯藏時期鮮切菠菜的品質(zhì)Fig.2 Quality of fresh cut spinach at different storage periods under 4 ℃ refrigeration

2.2 腐敗菌的初步鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化實驗

共挑取特征菌落29個，經(jīng)革蘭氏染色實驗，其中18株為革蘭氏陰性菌，11株為革蘭氏陽性菌，各菌株的鏡檢及生理生化實驗結(jié)果見表2。

表2 各個菌株的鏡檢及生理生化實驗結(jié)果Table 2 Microscopic examination and physiological and biochemical results of various strains

續(xù)表2

菌種編號P2-0、P3-2、P2-4、D1-0、D1-4、P1-8、D2-8P2-2、P2-6、V1-0、V2-4、V1-8、V3-8P1-0、P2-8、V3-4、V2-8P1-0、P3-0、P2-4、P1-8、C1-0、C2-2、C1-4、C2-8P1-0、P2-4、M1-0、M2-0菌落干濕度濕潤濕潤濕潤濕潤濕潤H2O2酶實驗-++++氧化酶實驗+--++明膠水解+-+++吲哚實驗NT+-NTNT葡萄糖利用+++++V-P實驗---++O-F實驗OFFOF初步結(jié)論梭菌腸桿菌腸桿菌假單胞菌葡萄球菌

2.2.2 腐敗菌的計數(shù)

根據(jù)對29株菌株的鏡檢以及生理生化的鑒定結(jié)果，分別對0、4、8 d的樣品在不同培養(yǎng)基中的典型菌落進(jìn)行計數(shù)并計算大致比例。由表3可知，在貨架期終點假單胞菌占比達(dá)到77.89%，為主要優(yōu)勢腐敗菌；腸桿菌在貯藏過程中比例下降至21.99%；微球菌、梭菌占比較少，分別為0.55%、0.51%。

表3 4 ℃條件下鮮切菠菜的菌群變化 單位:CFU/g

2.3 高通量測序鑒定

2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及稀釋度曲線

由表4可知，3個樣品經(jīng)過測序后分別得到48 353、62 689、53 046條原始序列，經(jīng)過質(zhì)量控制、去除非特異性擴(kuò)增序列和嵌合體得到44 183、50 954、46 064條有效序列，各個樣品的有效序列分別達(dá)到91.4%、81.3%、86.8%，片段長度約428 bp，均達(dá)到生物信息分析的要求[18]。

表4 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Table 4 The statistics results of sequence data

構(gòu)建稀釋曲線可以反映樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理，本實驗中，橫坐標(biāo)代表隨機(jī)抽取的序列數(shù)量，縱坐標(biāo)代表的是反映物種多樣性的Shannon指數(shù)，當(dāng)曲線趨于平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。圖3代表的是不同貯藏時期的3個樣品：當(dāng)測序數(shù)目分別達(dá)到44 183、50 954、46 064時，Shannon指數(shù)達(dá)到2.19、2.95、2.57，此時繼續(xù)增加測序數(shù)據(jù)量僅產(chǎn)生少量新的OTU，同時稀釋度曲線趨于平坦，這表明測序已趨于飽和，具有代表性。

圖3 各個樣品稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curve of each samples

2.3.2 Alpha多樣性分析

在4 ℃條件下，鮮切菠菜貯藏過程中的Alpha多樣性指數(shù)變化如表5所示。首先，各個樣品的Coverage指數(shù)均≥0.95，說明本實驗的測序數(shù)量充分代表樣品的真實情況[19]；從Chao1、ACE指數(shù)來看，貯藏4 d菠菜表面的菌群豐度最高，其次是0 d，最低的是8 d；從Shannon、Simpson指數(shù)來看：貯藏4 d菠菜表面的菌群多樣性也明顯高于0 d及8 d，以上說明：貯存4 d的菠菜樣品表面的微生物群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，這可能是由于在貯存初期(0～4 d)菠菜經(jīng)過鮮切處理后，導(dǎo)致組織液外滲，為微生物提供了較好的繁殖環(huán)境，導(dǎo)致豐度和多樣性上升，在貯存后期(4～8 d)優(yōu)勢腐敗菌憑借其競爭優(yōu)勢，消耗營養(yǎng)底物，使得環(huán)境改變，導(dǎo)致菌群多樣性降低。

表5 Alpha多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index

2.3.3 細(xì)菌群落分析

使用RDP classifier以及Blast分析對已得的OTU進(jìn)行物種分類，共鑒定到10門，15綱，23目，52科，89屬。本文在科、屬的分類水平上進(jìn)行分析。

2.3.3.1 基于科分類水平上的分析

經(jīng)過鑒定，在科的分類標(biāo)準(zhǔn)下，不同貯藏時間的鮮切菠菜表面菌群的豐度情況如圖4所示。

圖4 基于科分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.4 Bacterial distribution based on the family taxonomical level

由圖4得出，假單胞菌科和腸桿菌科是在整個貯藏期間的主要菌群結(jié)構(gòu)，兩者占比90%以上，為優(yōu)勢腐敗菌；而其他分類的菌群豐度較低，都小于2%，這表明菌群的多樣性程度較高，而豐度較為集中。從菌群變化的角度來看，隨著貯藏時間的推移，假單胞菌科的豐度呈遞增趨勢，從初始豐度的48.99%到貯藏末期的70.27%；而腸桿菌科則從初始豐度的48.62%不斷遞減至21.75%，其余菌群的微生物均保持在較低豐度，出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是以下原因?qū)е碌模?1)在樣品清洗后，假單胞菌科及腸桿菌科的微生物在菠菜葉片表面的黏附強(qiáng)于其他細(xì)菌，從而使二者的初始豐度較高[20]；(2)鮮切菠菜在4 ℃低溫下貯藏會明顯抑制腸桿菌的生長[21]，而假單胞菌對低溫具有一定的耐受力[22]，因此，假單胞菌生長速度快于腸桿菌，導(dǎo)致腸桿菌的豐度不斷下降，另一方面，二者的增殖會相對抑制其他科微生物的增長。

2.3.3.2 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖

經(jīng)過鑒定，在不同貯藏時期，鮮切菠菜表面的微生物在屬的分類水平下共得到89個屬，圖5為在屬的分類水平下豐度占比前十的菌群分布情況。在科水平下為優(yōu)勢腐敗菌的假單胞菌科，在屬的分類下包括：假單胞菌屬(Pseudomonas)、氮單孢菌屬(Azomonas)，對于腸桿菌科，在屬的分類下主要包括：泛菌屬(Pantoea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)，除了上述幾種外，豐度靠前的還有氮單孢菌屬(Azomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)等。

圖5 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.5 Bacterial distribution based on the genus taxonomical level

由圖5可知，假單胞菌屬、泛菌屬是鮮切菠菜的初始優(yōu)勢菌屬，豐度分別達(dá)到47.84%、30.7%，而歐文氏菌屬、布丘氏菌屬為次優(yōu)勢菌屬，豐度為8.09%和4.64%；到了貯存中期，假單胞菌屬的豐度上升至58.25%，泛菌屬豐度下降至13.94%，歐文氏菌屬豐度基本保持不變?yōu)?.69%、布丘氏菌屬豐度小幅上升至9.73%；貯存末期，假單胞菌屬占絕對優(yōu)勢，豐度占比68.97%，而泛菌屬豐度僅占5.4%，歐文氏菌屬占比10.7%，布丘氏菌屬占比4%。

已有文獻(xiàn)證實，假單胞菌屬是許多果蔬植物的腐敗菌，由于其營養(yǎng)方式多樣性及其生理特性，較為適應(yīng)鮮切菠菜表面的生長環(huán)境[23]，其豐度約占腐敗菌的50%～90%[24]，這和本研究結(jié)果一致，在該屬中，熒光假單胞菌(P.fluorescens)是引起鮮切菠菜軟腐變質(zhì)的主要細(xì)菌[25]，具有很強(qiáng)的產(chǎn)氨致腐能力，并且可通過PL編碼基因表達(dá)產(chǎn)生果膠酸裂解酶(Polygalacturonatelyase，PL)，PL的合成不受碳源種類的影響，并且會破壞菠菜葉片組織引起軟腐[26]。其次，P.fluorescens表面的鞭毛蛋白對更好地定植于鮮切菠菜表面起到了重要作用[27]，以上特點可能是其在整個貯藏期豐度變化的原因，而泛菌屬、歐文氏菌屬在低于10 ℃下生長緩慢，在加上營養(yǎng)底物被假單胞菌屬消耗，間接地抑制其生長。軟腐歐文氏菌屬除了分泌少量PL外，還會分泌果膠甲基半乳糖醛酸酶(Pectin methyl-galacturonase，PML)，有實驗證明：PML在軟化菠菜組織的作用不明顯，但是PME和PL的協(xié)同作用下可完全降解菠菜細(xì)胞壁上的果膠，從而發(fā)生軟腐敗[28]。

3 結(jié)論

本實驗借助高通量檢測技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)生理生化檢測技術(shù)探究在4 ℃貯藏條件下，鮮切菠菜不同貯藏時期的菌群變化，結(jié)論如下：

鮮切菠菜在不同貯藏時期其微生物的多樣性以及豐度存在較大差異，共鑒定到10門，15綱，23目，52科，89屬，其中假單胞菌科和腸桿菌科為優(yōu)勢菌科。

在屬水平上，假單胞菌屬(47.84%)、泛菌屬(30.7%)、歐文氏菌屬(8.09%)、布丘氏菌屬(4.64%)是鮮切菠菜的主要初始菌群結(jié)構(gòu)，到了貯存中后期，假單胞菌屬豐度不斷上升至68.97%，成為導(dǎo)致鮮切菠菜腐敗的主要菌屬，泛菌屬、歐文氏菌屬、布丘氏菌屬成為次要腐敗菌。

本實驗2種方法可進(jìn)行對比，進(jìn)一步驗證了高通量檢測技術(shù)的優(yōu)勢，精確地定量了菌群組成比例。