皮膚鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型的光聲成像及光聲譜分析

文龍 潘晶 王佩茹 張浩南 張國(guó)龍 王學(xué)鼎 程茜 王秀麗

1安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院 上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學(xué)治療科，上海 200443；2同濟(jì)大學(xué)物理科學(xué)與工程學(xué)院聲學(xué)研究所，上海 200092；3上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學(xué)治療科 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所 200443；4Department of Biomedical Engineering，University of Michigan，Ann Arbor，MI 48109，USA

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱鱗癌）是一種發(fā)生于上皮細(xì)胞的常見皮膚惡性腫瘤［1］，其確診依賴于組織病理檢查，但存在有創(chuàng)、耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣等不足。生物醫(yī)學(xué)光聲技術(shù)（photoacoustic）是一種基于光聲效應(yīng)的無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)［2］，近年已成為臨床醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。光聲效應(yīng)的原理為脈沖激光或連續(xù)調(diào)制激光被組織吸收后，引起組織周期性熱彈體積脹縮并以聲波形式傳輸出來(lái)，即光聲信號(hào)［3］。這些信號(hào)攜帶了組織的光學(xué)、彈性、熱力學(xué)和結(jié)構(gòu)等豐富的理化信息，通過(guò)處理分析后可用于疾病的診斷與組織的評(píng)估［4］。目前光聲技術(shù)在皮膚疾病中的研究較少，主要是基于對(duì)所獲光聲信號(hào)進(jìn)行圖像重建，達(dá)到對(duì)皮膚組織進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)或功能成像［5-7］。在皮膚腫瘤研究方面，多數(shù)研究聚焦于黑素瘤的光聲成像研究［8-9］，但皮膚鱗癌的光聲研究?jī)H有個(gè)別報(bào)道［10］。我們擬采用光聲成像及光聲譜技術(shù)研究?jī)煞N皮膚鱗癌小鼠模型，初步探索光聲技術(shù)在皮膚鱗癌無(wú)創(chuàng)診斷中的應(yīng)用。

一、材料與儀器

6～8周齡健康雌性SPF級(jí)BALB/C裸鼠60只（上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：18030521-4），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證［SCXK（滬）2018-0004］，體重約20 g，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，予以標(biāo)準(zhǔn)滅菌飼料和潔凈水飼養(yǎng)。人皮膚鱗癌A431細(xì)胞株（上海中喬新舟生物有限公司）；小鼠皮膚鱗癌XL50細(xì)胞系（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)：C201827）；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、青霉素/鏈霉素雙抗（美國(guó)Hyclone公司）。Acoustic X光聲成像系統(tǒng)（日本PreXion公司）。光聲譜檢測(cè)系統(tǒng)：脈沖激光器（美國(guó)OPOTEK公司），針式水聽器（美國(guó)Onda公司），放大器（日本Olympus公司），示波器（美國(guó)Teledyne LeCroy公司）。

二、建立XL50、A431裸鼠模型

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XL50細(xì)胞（與3T3細(xì)胞以5∶1比例混合）、A431細(xì)胞均按6×106個(gè)/只接種于裸鼠右側(cè)背部近上肢處，各接種30只，接種后按上述條件飼養(yǎng)。每日測(cè)量腫瘤直徑，選取腫瘤直徑為5～7 mm的小鼠各20只供實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，分別簡(jiǎn)稱為X-SCC、A-SCC。

三、光聲成像及光聲譜檢測(cè)

光聲成像時(shí)，用850 nm LED光源，脈沖重復(fù)頻率為4 kHz，脈沖寬度為70 ns，光功率密度＜5.98×103W/m2。成像平均次數(shù)為640次。使用陣列超聲探頭進(jìn)行成像檢測(cè)，探頭的中心頻率為9 MHz。將超聲耦合劑涂抹于瘤體及對(duì)側(cè)正常皮膚表面，成像探頭垂直于瘤體及正常皮膚進(jìn)行腫瘤和正常皮膚成像。

使用光聲譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)兩種皮膚鱗癌及左側(cè)背部正常皮膚進(jìn)行光聲譜檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，對(duì)腫瘤及正常皮膚組織進(jìn)行重復(fù)頻率為10 Hz、脈沖寬度5 ns的脈沖激光輻照，產(chǎn)生的光聲信號(hào)經(jīng)耦合劑耦合，由針式水聽器（帶寬1～20 MHz）接收；使用光闌控制使腫瘤與正常組織的激光輻照光斑尺寸相同，光斑直徑為8 mm。將獲得的兩種瘤體與正常組織的光聲數(shù)據(jù)進(jìn)行能量歸一，使用MATLAB 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，再用pWelch函數(shù)對(duì)光聲數(shù)據(jù)進(jìn)行時(shí)頻轉(zhuǎn)換，計(jì)算并繪制得到光聲功率譜，并在1.5～10 MHz聲頻范圍內(nèi)進(jìn)行線性擬合，提取光聲功率譜的擬合斜率。

四、組織病理學(xué)檢查

光聲檢測(cè)完成后，頸椎脫臼法處死小鼠，使用6 mm環(huán)鉆鉆取腫瘤組織及對(duì)側(cè)正常皮膚，4%中性甲醛固定后行組織病理檢查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

六、結(jié)果

1.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型光聲成像結(jié)果：850 nm波長(zhǎng)下光聲成像顯示，兩種皮膚鱗癌裸鼠模型各20只瘤體均可見較強(qiáng)的血紅蛋白光聲信號(hào)，正常皮膚未見明顯光聲信號(hào)（圖1）。

2.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型光聲譜的聲功率譜：光聲信號(hào)經(jīng)MATLAB 2016軟件分析及處理后，得到聲功率譜及擬合斜率（圖2）。X-SCC模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率（-1.827±0.153）低于正常皮膚組織（-1.059±0.118），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.973，P＜0.001）；A-SCC模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率（-1.537±0.126）亦低于對(duì)側(cè)正常皮膚組織（-0.960±0.260），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.166，P=0.043）。

圖1 小鼠鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤瘤體光聲成像圖光聲信號(hào)強(qiáng)度在光聲成像中以紅藍(lán)偽彩表示，兩種瘤體（黃色虛線圓圈所示）可見較強(qiáng)的血紅蛋白光聲信號(hào)（偽彩顏色越紅表示光聲信號(hào)越強(qiáng)），而正常皮膚（紅色虛線圓圈所示）未見明顯光聲信號(hào)

圖2 小鼠鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤瘤體的光聲聲功率譜曲線及擬合斜率2A：X-SCC；2B：A-SCC

3.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型組織病理結(jié)果：20只X-SCC小鼠腫瘤組織病理均可見腫瘤細(xì)胞致密排列，血管散在分布，相比正常皮膚組織血管增多并出現(xiàn)壞死出血；20只A-SCC小鼠腫瘤組織病理均顯示腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊樣，相比正常皮膚組織血管增多。見圖3。

七、討論

近年來(lái)，皮膚鏡、光學(xué)相干斷層成像（OCT）、皮膚共聚焦顯微鏡等在皮膚腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷領(lǐng)域取得一定進(jìn)展［11-14］，但以上技術(shù)均以光學(xué)成像為基礎(chǔ)，光在生物組織中具有強(qiáng)散射性，故穿透深度有限。以聲成像為基礎(chǔ)的技術(shù)如高頻超聲，可以提供較深的成像深度［15］，然而其信號(hào)反差源于生物組織的聲阻抗差異，因此難以區(qū)分化學(xué)性質(zhì)有所差異但物理性質(zhì)相差不大的腫瘤組織與正常組織。

圖3 小鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細(xì)胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤組織病理（圖中標(biāo)尺=100 μm）X-SCC腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞致密排列，血管增多并出現(xiàn)壞死出血；A-SCC腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊樣，血管增多

光聲技術(shù)利用光聲效應(yīng)形成光聲信號(hào)，這些信號(hào)攜帶了組織的光學(xué)、彈性、熱力學(xué)和結(jié)構(gòu)等豐富的理化信息。我們前期研究中，已將自行搭建的光聲成像系統(tǒng)用于膽管癌的成像，成功獲得膽管癌的光聲圖像［16］，還驗(yàn)證了光聲功率譜用于前列腺癌診斷的可行性，獲得前列腺癌的光聲譜特征［17］。本研究中，我們將光聲檢測(cè)用于X-SCC及A-SCC裸鼠模型的在體檢測(cè)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，故往往伴隨腫瘤新生血管的生長(zhǎng)［18］，組織內(nèi)血紅蛋白含量可以間接反映腫瘤相關(guān)新生血管的生長(zhǎng)。因此，我們檢測(cè)850 nm波長(zhǎng)（血紅蛋白特征吸收波長(zhǎng)）處光聲信號(hào)，光聲成像顯示兩種皮膚鱗癌裸鼠模型的瘤體內(nèi)可見強(qiáng)的光聲信號(hào)，說(shuō)明腫瘤中含豐富的血紅蛋白，這與病理顯示鱗癌瘤體內(nèi)血管、血液增多相符。既往研究報(bào)道，基于血紅蛋白特征波長(zhǎng)的光聲成像能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腎癌種植瘤內(nèi)新生血管的檢測(cè)［19］，因此，結(jié)合本研究的結(jié)果可以推測(cè)光聲可以對(duì)皮膚鱗癌進(jìn)行血液成分的成像從而反映腫瘤中增多的血管。

光聲譜檢測(cè)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)成功地獲得了兩種皮膚鱗癌與正常皮膚組織的光聲信號(hào)，信號(hào)較穩(wěn)定。同時(shí)，對(duì)所獲的光聲數(shù)據(jù)進(jìn)行能量歸一計(jì)算擬合斜率，顯示兩種皮膚鱗癌模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率均為負(fù)值，且均低于正常皮膚組織。光聲功率譜的擬合斜率的絕對(duì)值反映了組織中高頻信號(hào)的相對(duì)量，高頻信號(hào)越多代表組織結(jié)構(gòu)越不均勻或異質(zhì)性越大。Huang等［17］對(duì)不同分期的前列腺癌組織的研究表明相較于早期前列腺癌而言，晚期前列腺癌組織的擬合斜率絕對(duì)值明顯升高，對(duì)應(yīng)病理也顯示晚期前列腺癌的異質(zhì)性增高。本研究結(jié)果顯示皮膚鱗癌組織的擬合斜率絕對(duì)值相較于正常皮膚組織明顯升高，而組織病理結(jié)果也顯示鱗癌中腫瘤細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)異質(zhì)性高，與斜率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果一致。因此，光聲功率譜擬合斜率可以反映皮膚鱗癌的組織結(jié)構(gòu)變化。

綜上所述，我們成功獲得皮膚鱗癌的光聲成像和光聲譜數(shù)據(jù)，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)兩種皮膚鱗癌裸鼠模型腫瘤組織與正常皮膚850 nm波長(zhǎng)處光聲信號(hào)，發(fā)現(xiàn)兩種鱗癌裸鼠模型光聲信號(hào)的聲功率譜的斜率均顯著低于正常組織。本研究中僅選取血紅蛋白特征吸收波長(zhǎng)，獲得的腫瘤光聲數(shù)據(jù)較單一，今后我們將研究更多組分如膠原、色素、脂質(zhì)等物質(zhì)的特征波長(zhǎng)下的光聲數(shù)據(jù)，期望得到皮膚鱗癌以及更多的皮膚腫瘤的光聲數(shù)據(jù)，并在光譜及聲譜兩個(gè)維度展開研究，以期能初步對(duì)皮膚腫瘤進(jìn)行光聲的無(wú)創(chuàng)診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突