銀杏葉提取物對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度和骨生物力學的影響

張家國 徐曉峰 李明 王景靚

大連市第二人民醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116011

低骨量與遺傳、營養(yǎng)、生活方式以及雌激素水平和一些藥物的使用密切相關(guān)。在這些藥物中，糖皮質(zhì)激素具有強效的抗炎作用，并且已經(jīng)用于治療慢性疾病以及移植后免疫療法數(shù)十年[1]。目前皮質(zhì)類固醇的使用與嚴重的副作用有關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥和骨折增加[2]。盡管臨床上認識到糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致骨質(zhì)流失，但許多長期接受糖皮質(zhì)激素治療的患者未評估其骨骼健康狀況，也未接受特別的預(yù)防或治療[3-4]。糖皮質(zhì)激素直接作用于骨細胞，其主要作用之一是通過加速成骨細胞凋亡，減少成骨細胞的功能和數(shù)量[5]。Lucinda等[6]所述，成骨細胞的Bax表達在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(GIO)中增加。眾所周知，細胞凋亡受內(nèi)在過程的調(diào)控，該過程涉及激活可促進細胞死亡的基因[7]。同樣，Bcl-2基因家族編碼大量蛋白質(zhì)，包括參與程序性細胞死亡的Bcl-2基因家族的促細胞凋亡蛋白成員Bax[8]。生化標志物在骨質(zhì)疏松癥的處理中也是重要的，骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BAP) 是其中之一，它是在成骨過程中從成骨細胞釋放到血液中的特定酶，被認為是骨礦化過程的指標[9]。雙膦酸鹽廣泛用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥[10]，然而，一些副作用如胃腸不耐癥和下頜骨壞死已有報道[11]。因此，需要尋找新的方法來治療當前的疾病。植物雌激素在骨質(zhì)疏松癥的治療中顯示出顯著的結(jié)果[12]。同時，Trivedi等[13]表明銀杏葉提取物、山奈酚和槲皮素的植物雌激素成分參與骨骼的有益結(jié)果。銀杏葉(家庭銀杏科)是目前由接受不同治療方法的人群所使用的植物。該植物的主要化合物包含6%的萜類化合物(銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯)、低于5 ppm的銀杏酸和24%的植物雌激素。盡管目前缺乏臨床前研究以及使用銀杏治療骨質(zhì)疏松癥的臨床研究，但少數(shù)現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示在治療骨質(zhì)疏松癥方面其取得了令人鼓舞的結(jié)果[14]。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, Gbe)在治療骨質(zhì)疏松癥中可能起重要作用，部分作者報道了這種提取物的抗凋亡特性[14]。具體而言，Gbe在體外暴露于自由基的作用下可有效保護成骨細胞免于死亡。因此，銀杏對刺激成骨細胞分化和增加骨形成是有效的[14]。基于以上研究結(jié)果，本研究旨在評估Gbe在生物化學標志物BALP中的作用、對雙能X射線吸收測定法(DEXA)檢測骨密度(bone mineral density, BMD)以及用GIO處理的SD大鼠脛骨生物力學的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠(14周齡，重約250～290 g)從Juiz de Fora聯(lián)邦大學的動物園獲得，它們在那里出生并繁殖。將動物置于帶有不銹鋼絲蓋和松木屑作為被褥的透明塑料籠中，生活在具有受控環(huán)境條件(12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，溫度22 ℃)的密閉通風貨架上的動物房中。所有動物可以自由接近食物和水源。

1.2 實驗藥物

銀杏葉提取物注射液(臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司生產(chǎn)，每支含有銀杏葉提取物17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg);阿侖膦酸鈉片(70 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司)；地塞米松磷酸二鈉(上海北杰集團關(guān)東藥業(yè)有限公司)。

1.3 實驗設(shè)計

在該實驗中，隨機選擇60只14周齡的動物，均勻分成5組：骨質(zhì)疏松組[OP組，給予地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]；Gbe-1組[給予銀杏葉提取物28 mg (kg·d)聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]；Gbe-2組[給予銀杏葉提取物56 mg (kg·d)聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg· d)]；阿侖膦酸鈉組[ALN組，給予阿侖膦酸鈉0.2 mg (kg· d) 聯(lián)合地塞米松磷酸二鈉7 mg (kg·d)]和對照組(CON組);對照組未接受任何治療。每組再平均分為治療4周組與治療8周組。在骨質(zhì)疏松癥誘導(dǎo)4周后對ALN、Gbe-1和Gbe-2組進行灌胃治療，每天一次。治療4周和8周后分別對動物實施安樂死。用180 mg/kg和10 mg/kg劑量的賽拉嗪和氯胺酮進行腹腔麻醉，心臟穿刺取血樣5 mL。收集血液后，通過總放血使動物安樂死。將血樣在3 000 r/min下離心10 min，并將血清在-80 ℃保存直至分析。檢測血清骨特異性堿性磷酸酶(BAP)水平。取出右側(cè)脛骨并在-20 ℃下保存直至分析，然后在室溫下解凍4 h。

1.4 骨密度(BMD)檢測

脛骨的BMD使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通過雙能X射線吸收測定法(DEXA)來測量。使用小動物軟件進行分析，并對骨進行單獨評估。

1.5 生物力學參數(shù)

使用DL3000型通用機器EMIC對分離的右脛骨進行三點彎曲測試評估。通用機器以5 mm/min的加載速率裝配2 000 N容量的測力傳感器。在右脛骨骨干彎曲試驗中，支架兩點之間的距離標準化為三分之二的試樣，并且施加的負荷距各端等距。使用以下結(jié)構(gòu)-機械性能進行測試：彈性(mJ)，其被定義為樣品在彈性相中允許的能量；最大載荷(N)和剛度(103N/m)，它被定義為表示結(jié)構(gòu)剛度的載荷和變形之間的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用(平均值±標準差)表示，使用單因素方差分析(ANOVA)分析統(tǒng)計學顯著性，然后進行Tukey/Dunnett’T3事后檢驗(對照組除外)。使用Student’st-檢驗將對照組與骨質(zhì)疏松癥組進行比較。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后BAP值的改變

治療4周和8周后，OP組和ALN組顯示BAP水平顯著降低(P<0.05)，Gbe-1、Gbe-2組的BAP水平明顯增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 骨堿性磷酸酶(BAP)的水平(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進行比較，**P<0.05)Fig.1 Bone alkaline phosphatase (BAP) levels

2.2 治療前后BMD的改變

OP組BMD明顯低于CON組(P<0.05)， Gbe-1、Gbe-2和ALN組的BMD在治療4周和8周顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖2 使用雙能X線吸收儀測量骨密度的結(jié)果(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進行比較,**P<0.05)Fig.2 Measurements of bone mineral density (BMD) using a dual-energy X-ray absorptiometry bone densitometer

2.3 治療前后骨生物力學的改變

與CON組相比，OP組顯示大鼠脛骨剛度、最大載荷和彈性明顯降低(P<0.05)，Gbe-1，Gbe-2和ALN組的剛度、最大載荷和彈性在治療4周和8周后顯著增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 三點彎曲測試的結(jié)果(CON組與OP組比較，*P<0.05;除CON組外，所有組均與OP組進行比較,**P<0.05)Fig.3 Results of a three-point bending test

3 討論

據(jù)筆者了解，已經(jīng)進行的那些用于評估Gbe在骨質(zhì)疏松癥中作用的臨床前研究，大多數(shù)以卵巢切除誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠為模型。此項研究是首次評估Gbe對GIO誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的影響。本研究的目的是通過骨生物力學和BMD來評估Gbe治療對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥恢復(fù)的效果。在本研究中，通過DEXA評估骨密度，DEXA是骨質(zhì)疏松癥臨床評估的金標準。筆者觀察到使用糖皮質(zhì)激素顯著降低了大鼠血清BAP、BMD、脛骨的最大負荷、彈性和剛度。用Gbe治療可有效恢復(fù)BAP、BMD水平，表明銀杏葉提取物可增加這些動物的骨量。有研究表明[6]銀杏葉提取物可以減少成骨細胞的凋亡，而本研究中BAP水平降低在治療后得到恢復(fù)也證實了銀杏葉提取物可以促進成骨細胞活性。

骨脆性可以通過生物力學參數(shù)來定義，并且受到骨轉(zhuǎn)換、微型結(jié)構(gòu)、礦化、微損傷、膠原交聯(lián)和礦物晶體結(jié)構(gòu)等多個因素的影響[15]。糖皮質(zhì)激素與快速和顯著的骨丟失以及骨折風險增加密切相關(guān)。在本研究中，GIO不僅表明骨密度明顯下降，而且顯示骨的生物力學參數(shù)如骨剛度、最大負荷和彈性下降。Gbe和阿侖膦酸鈉不僅增加了BMD，脛骨的生物力學參數(shù)也有不同程度的改善。 Sliwiński等[16]的研究顯示阿侖膦酸鈉治療股骨干骨礦物質(zhì)含量增加；筆者的研究顯示阿侖膦酸鈉對脛骨干的力學性能影響顯著。另外，Sliwiński等報告，與去卵巢大鼠相比，股骨頸是一種以小梁骨為主的區(qū)域，其負荷顯著增加。這些結(jié)果表明阿侖膦酸鈉和Gbe對骨小梁和骨皮質(zhì)的影響都較大，皮質(zhì)骨存在于長骨的骨干中，如同一些研究人員所得出的研究結(jié)果[17]，其缺乏骨密度和骨折風險之間的相關(guān)性。

雖然BMD測量是骨質(zhì)疏松癥診斷中最重要的工具之一，但它越來越清楚地表明其并不能反映骨強度的所有成分。對于骨質(zhì)疏松癥的治療藥物，如雙膦酸鹽，已顯示其對骨密度的改善；然而，這些變化僅提供關(guān)于骨小梁損失或其數(shù)量的信息，并不能完全說明包括皮質(zhì)骨在內(nèi)結(jié)構(gòu)變化的機械性質(zhì)的改變[18]。例如，用利塞膦酸鈉治療的患者骨密度增加與骨折發(fā)生率無關(guān)[18]。但此次研究的數(shù)據(jù)顯示Gbe和阿侖膦酸鈉除了對BMD的改善，也會影響生物力學特性。據(jù)筆者所知，此次研究首次評估了Gbe對脛骨干骨生物力學參數(shù)的影響，結(jié)果表明Gbe顯著增加了生物力學參數(shù)。此次研究結(jié)果表明治療時間和Gbe的劑量雖然不足以完全恢復(fù)脛骨的皮質(zhì)骨，但是相同劑量和時間的Gbe治療對牙槽骨有著良好的效果[14]。Trivedi等[13]報道了較高劑量[100 mg (kg·d)] Gbe對卵巢切除大鼠的脛骨皮質(zhì)骨增加更為顯著。

總之，用GIO進行治療將降低骨密度和骨生物力學參數(shù)，如骨硬度、最大負荷和彈性。此次研究的結(jié)果表明Gbe可以部分恢復(fù)大鼠的BMD，但脛骨生物力學參數(shù)沒有改善。