3-(4′-苯甲?；被?苯基)-香豆素衍生物的合成及體外降血糖活性

胡玉恒，孫 捷，楊 潔，王曉靜*

(1濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南 250200；2山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，濟南 250062；3國家衛(wèi)生部生物技術藥物重點實驗室，濟南 250062；4山東省罕見病重點實驗室，濟南 250062)

芳基香豆素是以芳基苯并吡喃酮為骨架的天然產(chǎn)物。近年來，芳基香豆素衍生物的合成與活性研究已成為活性天然產(chǎn)物研究的熱點之一，具有多種結(jié)構(gòu)修飾類型的芳基香豆素衍生物被設計、合成得到，并在此基礎上做了大量的活性研究[1-3]。研究表明芳基香豆素衍生物具有多種生物活性，如抗腫瘤[4]、抗白血病[5]、抗過敏[6]、抗炎[7]、抗氧化劑[8]、抗菌[9]等。

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，其主要特征是持續(xù)性的高血糖[10]，最終導致人體內(nèi)碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等代謝的改變[11]。α-葡萄糖苷酶是錨定在小腸刷狀緣一種特定的酶，主要負責催化碳水化合物的水解[12]，其抑制劑可用于治療2型糖尿病[13]。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成抑制劑能與多種受體相互作用關閉多個信號傳導通路，減少相關因子的合成和釋放，進而達到降血糖和減輕糖尿病的并發(fā)癥[14]。最近的研究表明含有香豆素骨架的化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[15-16]，結(jié)合本課題組之前對4-芳基香豆素降血糖活性的研究[2]，本研究設計、合成了一系列的3-芳基香豆素衍生物并對其體外降血糖活性進行評價。

1 合成路線

目標化合物7a～7j的合成路線如圖1所示。對氨基苯乙酸1和取代水楊醛2a～2c在乙酸酐和三乙胺的混合液中發(fā)生Perkin反應得到化合物3a～3c，然后化合物3a～3c經(jīng)過鹽酸酸化得到中間體3-芳基香豆素類化合物4a～4c；以取代苯甲酸5a～5g在草酰氯的作用下來制備取代苯甲酰氯6a～6b；中間體3-芳基香豆素類化合物4a～4c與取代苯甲酰氯6a～6b在丙酮和吡啶的混合液中發(fā)生酰胺化反應得到目標化合物7a～7j。

Scheme1 Synthetic route of the title compounds7a-7c
(a) Acetic anhydride,Et3N,115 °C;(b) HCl ethanol;(c)(COCl)2,DCM,reflux;(d)4a-4c,acetone,pyridine,r.t.

2 實驗部分

2.1 材 料

核磁共振儀(德國BrukerAM-600);F-280雙光速熒光分光光度計(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；318C+酶標儀(上海沛歐分析儀器有限公司)。

對氨基苯乙酸(純度≥96%)、2、4-二羥基苯甲醛(純度≥98%)、2、3、4-三羥基苯甲醛(純度≥98%)、草酰氯(純度≥98%)、鄰香草醛(純度≥99%)、間甲基苯甲酸(純度≥99%)、間氯苯甲酸(純度≥99%)、鄰氟苯甲酸(純度≥98%)、對氯苯甲酸(純度≥99%)、3、5-二甲基苯甲酸(純度≥98%)、對氟苯甲酸(純度≥98%)、4-三氟甲基苯甲酸(純度≥98%)、2、3-二氯苯甲酸(純度≥97%)、對氯甲基苯甲酸(純度≥98%)、氨基胍鹽酸鹽、阿卡波糖，以上試劑均來自上海麥克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶制劑(美國Sigma Aldrich公司)；丙酮、吡啶、二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺等均為市售分析純。

2.2 化學合成

2.2.1 中間體3-(4′-氨基苯基)-7-羥基香豆素(4a)的合成 在100 mL的三口反應瓶中，依次加入2,4-二羥基苯甲醛(2a，1.38 g，10 mmol)、對氨基苯乙酸(1，1.51g，10 mmol)、三乙胺(5.56 g，55 mmol)和乙酸酐(6.12 g，60 mmol)，于115 ℃下回流攪拌，TLC監(jiān)測反應進程，反應6 h 后將反應液倒入冰水100 mL中并用磁力攪拌器不斷攪拌，析出大量固體，靜置，抽濾，用水洗滌濾餅3～4次，真空干燥箱干燥，不經(jīng)過純化直接進行下一步反應。將上一步得到的化合物加入到無水乙醇30 mL中加熱 10 min后，加入鹽酸(10%)40 mL進行酸化反應6 h，反應完畢后將反應液倒入冰水100 mL中，析出大量的淡綠色固體粉末，減壓抽濾，真空干燥箱干燥，得到化合物4a1.97 g，產(chǎn)率78%，mp：294.3～296.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:10.67(1H,s,7-H),8.09(1H,s,4-H),7.64(2H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),7.58(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.07(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.84(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:161.52,160.65,155.12,140.22,130.19,129.76,122.22,119.07,113.86,112.54,102.17。m/z:253.8[M+H]+。

2.2.2 中間體3-(4′-氨基苯基)-8-甲氧基香豆素(4b)的合成 中間體4b的合成方法同化合物4a。淡黃色固體粉末，產(chǎn)率82%，mp：267.6～269.5 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:8.24(1H,s,4-H),7.77(2H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),7.35～7.30(3H,m,Ar-H),7.27(2H,d,J=8.4 Hz,Ar-H),3.93(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:159.93,146.70,142.60,140.62,130.20,126.69,125.06,121.13,120.52,120.23,114.30,56.56。m/z:269.09[M+H]+。

2.2.3 中間體3-(4′-氨基苯基)-7,8-二羥基香豆素(4c)的合成 中間體4c的合成方法同化合物4a。淡黃色固體粉末，產(chǎn)率72%，mp：305.9～308.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:8.15(1H,s,4-H),7.84～7.74(2H,m,Ar-H),7.37(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.11(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.88(1H,d,J=8.4 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:160.49,150.21,143.64,142.28,132.34,130.03,122.54,121.39,119.71,113.39,113.17。m/z:270.07[M+H]+。

2.2.4 取代苯甲酰氯6a～6g的合成 以間甲基苯甲酰氯的合成為例，在100 mL的三口反應瓶中，依次加入間甲基苯甲酸(0.28 g，2 mmol)、過量的草酰氯(1.28 mL，15 mmol)、重蒸過的二氯甲烷20 mL，然后滴加1～2滴N,N-二甲基甲酰胺并將混合物加熱回流，TLC監(jiān)測反應進程，2 h后反應完畢并將混合物冷卻至室溫，在真空條件下除去多余的草酰氯和二氯甲烷。粗制苯甲酰氯無需進一步純化即可用于下一步合成反應，本實驗所用到的取代酰氯6b～6g也是根據(jù)此方法制備。

2.2.5 目標化合物7a～7j合成 以化合物7a的制備方法為例，在100 mL的三口反應瓶中加入化合物4a(0.51 g，2 mmol)并加入重蒸過的丙酮20 mL，將反應瓶置于攪拌器中攪拌10 min后加入吡啶15 mL，在冰水浴的條件下滴加3-甲基苯甲酰氯，滴加完畢后撤去冰水浴，常溫攪拌，TLC檢測反應進程，反應7 h后將反應溶液倒入冰水100 mL中并用磁力攪拌器不斷攪拌，此時析出大量固體，靜置，抽濾，濾餅用水洗至中性并干燥固體。將所得到的固體加入乙醇中進行回流洗滌，冷卻靜置，抽濾，干燥，得到淺黃色固體7a0.63 g，收率85%，目標產(chǎn)物7b～7j同上述方法合成。

3-[4′-(3′-甲基-苯甲?；被?-苯基]-7-羥基香豆素(7a) 淺黃色固體，產(chǎn)率85%，mp：265.2～266.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.33(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),7.86(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.80(1H,s,Ar-H),7.77(1H,d,J=6.5 Hz,Ar-H),7.72(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.61(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.43(2H,d,J=6.6 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.2 Hz,1H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),2.42(3H,s,Ar-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：166.16,161.56,160.61,155.24,140.72,139.57,138.20,135.32,132.70,130.62,130.34,128.96,128.79,128.63,125.34,122.21,120.26,113.86,112.57,102.18。m/z:371.9[M+H]+。

3-[4′-(3′-氯-苯甲?；被?-苯基]-7-羥基香豆素(7b) 黃色固體，產(chǎn)率81%，mp：304.9～306.0 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.60(1H,s,N-H),10.47(1H,s,7-H),8.18(1H,s,4-H),8.04(1H,t,J=1.8 Hz,Ar-H),7.98～7.90(1H,m,Ar-H),7.88～7.79(2H,m,Ar-H),7.77～7.71(2H,m,Ar-H),7.68(1H,d,J=8.0,Ar-H),7.60(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.55,161.60,160.59,155.27,140.83,139.21,137.26,133.71,131.96,130.96,130.92,130.37,129.01,127.92,127.02,122.14,120.39,113.88,112.56,102.19。m/z:413.9[M+Na]+。

3-[4′-(2′-氟-苯甲?；被?-苯基]-7-羥基香豆素(7c) 淺粉色固體，產(chǎn)率72%，mp：268.9～372.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.54(1H,s,7-H),8.16(1H,s,4-H),7.80(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.71(3H,d,J=5.1 Hz,Ar-H),7.61(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.36(2H,d,J=2.5 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：163.29,161.59,160.59,155.27,140.80,139.17,130.90,130.42,130.40,130.36,129.13,125.07,125.05,122.14,119.73,116.73,116.59,113.87,112.55,102.18。m/z:376.0[M+H]+。

3-[4′-(4′-氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羥基香豆素(7d) 淺綠色固體，產(chǎn)率80%，mp：313.2～315.0 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.43(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),8.08～7.98(2H,m,Ar-H),7.89～7.82(2H,m,Ar-H),7.78～7.69(2H,m,Ar-H),7.67～7.57(3H,m,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.93,161.58,160.59,155.26,140.80,139.31,136.96,133.99,130.86,130.36,130.15,128.99,128.97,122.16,120.36,113.87,112.56,102.18。m/z:391.9[M+H]+。

3-[4′-(2′,3′-二甲基-苯甲?；被?-苯基]-7-羥基香豆素(7e) 白色固體，產(chǎn)率72%，mp：250.2～252.3 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.58(1H,s,N-H),10.28(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),7.85(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.75～7.66(2H,m,Ar-H),7.64～7.53(3H,m,Ar-H),7.23(1H,s,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),4.35(1H,t,J=5.1 Hz,Ar-H),2.37(6H,s,Ar-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：166.27,161.55,160.61,155.24,140.70,139.61,138.05,135.35,133.39,130.56,130.34,128.94,125.86,122.23,120.23,113.86,112.57,102.18。m/z:386.1[M+H]+。

3-[4′-(4′-氟-苯甲?；被?-苯基]-8-甲氧基香豆素(7f) 白色固體，產(chǎn)率78%，mp：296.5～297.8 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.42(1H,s,N-H),8.26(1H,s,4-H),8.07(2H,s,Ar-H),7.88(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.78(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.39(2H,t,J=7.6 Hz,Ar-H),7.36～7.26(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：165.00,163.79,159.97,146.72,142.60,140.34,139.99,131.70,130.99,130.93,130.16,129.30,126.91,125.02,120.62,120.30,120.23,115.93,115.79,114.24,56.58。m/z:390.1[M+H]+。

3-[4′-(4′-三氟甲基-苯甲?；被?-苯基]-8-甲氧基香豆素(7g) 白色固體，產(chǎn)率68%，mp：298.1～301.5 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.63(1H,s,N-H),8.27(1H,s,4-H),8.18(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.94(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),7.90(2H,d,J=8.8 Hz,Ar-H),7.84～7.76(2H,m,Ar-H),7.40～7.27(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.95,159.95,146.72,142.62,140.44,139.71,130.47,129.36,129.15,126.86,125.92,125.89,125.02,120.61,120.38,120.24,114.26,56.57。m/z:461.9[M+Na]+。

3-[4′-(3′-氯-苯甲?；被?-苯基]-8-甲氧基香豆素(7h) 白色固體，產(chǎn)率81%，mp：265.3～266.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.50(1H,s,N-H),8.27(1H,s,4-H),8.04(1H,s,Ar-H),7.95(1H,d,J=7.5 Hz,Ar-H),7.88(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.79(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.69(1H,d,J=7.8 Hz,Ar-H),7.59(1H,t,J=7.8 Hz,Ar-H),7.41～7.24(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.63,159.96,146.73,142.62,140.41,139.78,137.22,133.72,132.01,130.94,130.36,129.33,129.31,127.94,127.05,126.88,125.03,120.62,120.36,120.24,114.27,56.58。m/z:428.0[M+Na]+。

3-[4′-(2′,3′-二氯-苯甲?；被?-苯基]-8-甲氧基香豆素(7i) 白色固體，產(chǎn)率62%，mp：258.6～261.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.76(1H,s,N-H),8.25(1H,s,4-H),7.83～7.74(5H,m,Ar-H),7.61(1H,d,J=7.6 Hz,Ar-H),7.51(1H,t,J=7.8 Hz,Ar-H),7.37～7.28(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.72,159.95,146.73,142.63,140.44,139.54,132.58,131.91,130.51,129.54,129.22,128.62,127.90,126.86,125.03,120.59,120.25,119.59,114.29,56.58。m/z:391.9[M+H]+。

3-[4′-(4′-氯甲基-苯甲?；被?-苯基]-7,8-二羥基香豆素(7j) 黃色固體，產(chǎn)率58%，mp：285.3～286.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.40(1H,s,N-H),10.13(1H,s,7-H),9.41(1H,s,8-H),8.13(1H,s,4-H),7.99(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.86(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.74(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.61(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),7.11(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.84(1H,d,J=8.4 Hz,Ar-H),4.86(2H,s,Ar-CH2)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：165.59,160.57,149.94,143.54,141.61,141.34,139.39,135.15,132.28,130.85,129.28,129.01,128.57,121.92,120.29,119.55,113.35,113.28。m/z:422.0[M+H]+。

2.3 體外降血糖活性測定

2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 參照文獻報道[17-18]的方法并稍做修改，對目標化合物7a～7j進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。取96孔板，在每個孔中依次加入PBS緩沖液(pH 6.8)、對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)和待測化合物，每一組濃度設置3個復孔。利用混勻器將96孔板內(nèi)的反應液混勻，然后置于37 ℃的恒溫箱中保溫10 min，之后加入酶活力為0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，使用混勻器將其混勻并在恒溫箱中反應20 min，最后加入0.2 mol/L碳酸鈉175 μL終止反應。利用酶標儀檢測對硝基苯酚(PNP)在波長405 nm下的吸收度來反應α-葡萄糖苷酶的抑制率。通過以下公式算出所有化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率，實驗結(jié)果如表1所示。抑制率=[(AC-AB)-(AS-ASB)]/(AC-AB)×100%，式中，AC為對照組吸收度；AB為空白組吸收度；AS為樣品組吸收度；ASB為樣品空白組吸收度。

式中，AC：50 μL PBS+50 μL PNPG底物+25 μL DMSO+175 μL碳酸鈉的吸收度；AB：25 μL PBS+50 μL PNPG底物+25 μL蒸餾水+25 μL酶+175 μL碳酸鈉的吸收度；AS：25 μL PBS+25 μL待測目標化合物或阿卡波糖+50 μL PNPG底物+25 μL酶+175 μL碳酸鈉的吸收度；ASB：50 μL PBS+25 μL待測目標化合物或阿卡波糖+50 μL PNPG底物+175 μL碳酸鈉的吸收度。

2.3.2 AGEs形成抑制活性測定 參照Ni等[19]報道的方法并做相應調(diào)整，檢測了目標化合物的AGEs形成抑制活性。配制50 mmol/L 的PBS(pH 7.4)緩沖液，并用此緩沖液配制10 mg/mL牛血清白蛋白、0.2 mol/L葡萄糖、0.02%疊氮化鈉溶液(起到抑菌的作用)。取5 mL的EP管，依次加入上述液體各1 mL和不同濃度的待測樣品1 mL，利用混勻器將反應液混勻。將含有反應液的EP管置于37 ℃的恒溫箱中反應，每組實驗設定3個平行對照，14 d之后測定糖基化終產(chǎn)物的熒光吸收度(發(fā)射波長420 nm、激發(fā)波長350 nm)。陽性藥為氨基胍鹽酸鹽(AG)，實驗結(jié)果如表1所示。

Compd.IC50/(μmol/L)α-Glucosidase inhibitory activityAGEs form inhibitory activity7a56.61±0.54NA7b24.29±0.9631.97±2.417c42.67±0.3617.33±0.897d60.30±0.1823.02±2.457e43.47±0.98NA7f10.84±0.36NA7gNA5.01±0.557hNA15.43±0.837iNA38.15±2.277j42.75±2.1114.32±0.27Acarbose0.08±0.01NAAGNA290.31±7.32

NA：No relevant activity was detected;AG:Amino guanidine

Inhibition=[(AC-AB)-(AS-ASB)]/(AC-AB)×100%

式中，AC為對照組吸收度；AB為空白組吸收度；AS為樣品組吸收度；ASB為樣品空白組吸收度。

式中，AC：1.0 mL葡萄糖+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL疊氮化鈉+1.0 mL DMSO的吸收度；AB：1.0 mL PBS+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL 疊氮化鈉+1.0 mL DMSO的吸收度；AS：1.0 mL葡萄糖+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL疊氮化鈉+1.0 mL待測樣品或陽性藥的吸收度；ASB：1.0 mL PBS+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL疊氮化鈉+1.0 mL待測樣品或陽性藥的吸收度。

3 結(jié)果與討論

本研究設計合成10個未見文獻報道的3-(4′-苯甲酰基氨基-苯基)香豆素類化合物7a～7j，分別利用酶標儀和熒光分光光度計測定目標化合物7a～7j對α-葡萄糖苷酶和AGEs形成抑制活性，尋找潛在的具有降血糖活性化合物。

由表1所示，多數(shù)化合物對α-葡萄糖苷酶和AGEs形成具有一定的抑制活性。所有的目標化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性和陽性藥相比具有一定的差距，但是能夠檢測到活性的化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性也都低于65 μmol/L。構(gòu)效關系表明，化合物7b和7h只存在香豆素環(huán)上的7位和8位(化合物7b在7位上帶有羥基，化合物7h在8位上帶有甲氧基)取代基的差異，化合物7b對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性而化合物7h不具有抑制活性；化合物7f通過酰胺鍵連接苯環(huán)的對位含有一個氟原子取代基團，該化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性優(yōu)于其他化合物。以上結(jié)果表明香豆素環(huán)7位上羥基取代位點和與酰胺鍵連接苯環(huán)的對位氟原子取代的位點都是α-葡萄糖苷酶抑制活性位點。所有能檢測到的化合物對AGEs形成抑制活性都遠高于陽性藥物氨基胍鹽酸鹽，而且目標化合物7g對AGEs形成抑制活性高于陽性藥氨基胍鹽酸鹽接近58倍。這些體外活性的研究為以后體內(nèi)活性的研究提供了一定的理論依據(jù)，具有很好的參考價值。