超聲波-微波輔助溶劑提取胡椒鮮 果油樹(shù)脂的工藝研究

吳桂蘋(píng),賈雯,谷風(fēng)林*,譚樂(lè)和,張衛(wèi)明,張鋒倫

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬(wàn)寧 571533；2.國(guó)家重要熱帶作物工程技術(shù) 研究中心，海南 萬(wàn)寧 571533；3.海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心， 海南 萬(wàn)寧 571533；4.南京野生植物綜合利用研究院，南京 211100)

胡椒(PipernigrumL.)，又名黑川、白川、浮椒及王椒等，為胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物，是世界上重要的調(diào)味香料[1]。世界上胡椒主要分布在南美洲的中部和北部，主產(chǎn)國(guó)是印度、印度尼西亞、越南等，我國(guó)胡椒種植面積和產(chǎn)量分別居世界第6 位和第5 位。海南省是我國(guó)胡椒的主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)的90%以上，種植面積約33萬(wàn)畝，產(chǎn)量約3.8萬(wàn)噸，年均產(chǎn)值20 多億元[2]。海南省已有70多年的胡椒種植和加工歷史，但90%以上的胡椒鮮果被加工成白胡椒粒、白胡椒粉等初產(chǎn)品，極少部分被加工成黑胡椒，而白胡椒、黑胡椒等初產(chǎn)品的傳統(tǒng)加工一般需要3～7天才能將其水分含量曬干至12%以下。胡椒鮮果中水分含量約70%～80%，含有少量的多酚類(lèi)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3]。胡椒油樹(shù)脂是采用溶劑提取或超臨界流體等技術(shù)將胡椒中的風(fēng)味活性物質(zhì)提取出來(lái)的混合膏狀物，其主要成分是胡椒堿，其次是β-石竹烯、檸檬烯等風(fēng)味物質(zhì)[4]，已被列入食品添加劑，可作為肉類(lèi)食品、調(diào)味產(chǎn)品、飲料和烈性酒等的調(diào)配香料[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究報(bào)道了溶劑提取[6-8]、超聲波法[9]、微波提取法[10，11]、超臨界流體萃取法[12]等不同方法提取胡椒油樹(shù)脂的得率，并對(duì)胡椒油樹(shù)脂中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定[13]。吳桂蘋(píng)等研究報(bào)道了不同提取方法對(duì)黑胡椒油樹(shù)脂得率及其胡椒堿含量的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波-微波協(xié)同萃取所得黑胡椒油樹(shù)脂得率最高，Kelly等發(fā)現(xiàn)胡椒油樹(shù)脂具有較強(qiáng)的抗菌活性[14，15]。但目前尚未見(jiàn)直接以胡椒鮮果為原料提取胡椒油樹(shù)脂的研究報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)以胡椒鮮果為原料，采用超聲波-微波協(xié)同萃取法提取胡椒油樹(shù)脂，并對(duì)其加工工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，為胡椒鮮果的直接利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡椒鮮果：由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，為印尼大葉種胡椒的果實(shí)。

無(wú)水乙醇(分析純)：西隴化工股份有限公司；甲醇(色譜純)：德國(guó)默克公司；胡椒堿(色譜純，純度>98.00%)： 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000超聲波-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；HW.SY11型電熱恒溫水浴鍋 常州恒隆儀器有限公司；MF15磨漿機(jī) 廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司；HDM-100電熱套 常州國(guó)華電器有限公司；AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將胡椒鮮果粒清洗干凈，用磨漿機(jī)將其磨成漿，保存至4 ℃冰箱中待測(cè)。

1.3.2 單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)

單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)均在超聲波-微波協(xié)同萃取儀中進(jìn)行，其中，超聲波選擇開(kāi)啟，微波功率為300 W，提取溫度為55 ℃，選取料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)、乙醇濃度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取時(shí)間(10，15，20，25，30 min)3個(gè)因素，以提取的胡椒油樹(shù)脂得率與油樹(shù)脂中的胡椒堿含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以胡椒油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量為響應(yīng)值，選取提取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素，采取三因素三水平響應(yīng)曲面分析法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平值及編碼值見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.3 胡椒堿含量測(cè)定

用高效液相色譜儀檢測(cè)上清液中的胡椒堿含量，儀器檢測(cè)條件參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 17582-2009，即以甲醇和水為流動(dòng)相，體積比為77∶23，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm，進(jìn)樣量為10 μL，外標(biāo)法定量。即準(zhǔn)確稱(chēng)取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品0.0013 g，加入95%乙醇溶解后定容至10 mL棕色容量瓶中，取1.0 mL該溶液配制25 mL工作液，并用工作液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過(guò)0.45 μm有機(jī)膜，用高效液相色譜儀檢測(cè)。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)線(xiàn)性擬合得到回歸方程：y=113.51x-47.69，相關(guān)系數(shù)為0.9963。

1.3.4 胡椒油樹(shù)脂得率計(jì)算

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010、Origin 9.0、SPSS Statistics 20、Design-Expert 8.0.6 Trial軟件及儀器自帶軟件處理，平均數(shù)之間的比較采用方差分析中的LSD與Duncan多重比較對(duì)比分析，差異顯著性水平P<0.05和P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響

圖1 料液比對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂 中胡椒堿含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖1 可知，隨著料液比的增加，胡椒油樹(shù)脂的得率呈先緩慢增加后逐漸降低的趨勢(shì)。在料液比為1∶35 (g/mL)時(shí)，胡椒油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量都達(dá)到最高，分別為13.2%和34.212%，而且在料液比為1∶30～1∶35 (g/mL)之間，胡椒油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量均有明顯的變化趨勢(shì)，因此，選擇料液比的范圍為1∶30～1∶40 (g/mL)。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂 中胡椒堿含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖2可知，乙醇濃度在60%～70%之間油樹(shù)脂得率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，乙醇濃度達(dá)到70%后油樹(shù)脂得率逐漸降低，在乙醇濃度70%時(shí)達(dá)到最大值。油樹(shù)脂中胡椒堿含量在60%～90%之間慢慢趨于穩(wěn)定，在乙醇濃度為100%時(shí)含量最高。由于此次試驗(yàn)以胡椒油樹(shù)脂的得率為主要考察指標(biāo)，所以綜合考慮，乙醇濃度的選擇范圍為60%～80%。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率及油樹(shù)脂 中胡椒堿含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of pepper oleoresin and content of piperine in oleoresin

由圖3可知，油樹(shù)脂得率與油樹(shù)脂中胡椒堿含量都在提取時(shí)間為15 min時(shí)達(dá)到最高，分別為16.75%和23.262%，之后逐漸下降，且胡椒堿的含量慢慢趨于穩(wěn)定。在提取時(shí)間為10～20 min左右時(shí)，油樹(shù)脂得率與油樹(shù)脂中胡椒堿含量均比較高，保持了一個(gè)良好的趨勢(shì)。所以，選擇提取時(shí)間的范圍為10～20 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，分別表示為A，B，C。以胡椒油樹(shù)脂得率與油樹(shù)脂中胡椒堿含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對(duì)表2中的胡椒油樹(shù)脂得率進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，參照方差分析對(duì)模型的擬合進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該模型的P值等于0.0046，小于0.05，說(shuō)明模型擬合性較好，失擬差P值等于0.0646，大于0.05，該模型的失擬性不顯著，得到的多元二次回歸模型為：

油樹(shù)脂得率(R1)=16.00+0.050A-0.35B+0.40C+0.15AB-0.35AC+0.050BC-0.47A2-0.48B2-0.27C2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：“*”代表差異顯著，P<0.05；“**”代表差異極顯著，P<0.01，下同。

由表3可知，其中B、C、A2和C2均達(dá)到顯著(P<0.05)。由料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)影響因素的F值大小得知其對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率的影響大小排序?yàn)椋篊>B>A。除此之外，決定系數(shù)R2=0.8556，表明該方程能夠解釋85.56%的響應(yīng)值的變化，試驗(yàn)誤差較小，因此可以用該模型對(duì)胡椒鮮果油樹(shù)脂的提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

同樣利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對(duì)表2中胡椒油樹(shù)脂中胡椒堿的含量進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，該模型的P值等于0.0282，小于0.05，擬合性顯著，失擬差P值等于0.2067，大于0.05，顯示失擬性不顯著，說(shuō)明擬合的方程顯著性良好，得到的多元二次回歸模型為：油樹(shù)脂中的胡椒堿含量(R2)=23.67+0.14A+1.47B-0.21C-0.00425AB+1.32AC+0.64BC+1.45A2+0.59B2+0.36C2。

由表3可知，B、AC和A2均達(dá)到極顯著(P<0.01)，得知3個(gè)影響因素對(duì)油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響大小排序?yàn)椋築>C>A。同時(shí)，通過(guò)分析，油樹(shù)脂中胡椒堿含量的R2值為0.9184，其校正決定系數(shù)的值為0.8134，表明油樹(shù)脂中胡椒堿含量的模型擬合度較好，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析工藝優(yōu)化的結(jié)果。

2.2.2 各因素間的交互作用

根據(jù)回歸方程，利用Design-Expert做因子間的響應(yīng)面分析圖和等高線(xiàn)圖，因素間的交互作用對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 因素間的交互作用對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率影響的 響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the yield of pepper oleoresin

根據(jù)圖4的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖來(lái)分析料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)胡椒油樹(shù)脂提取得率的影響。料液比和乙醇濃度對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率的影響最大，由其響應(yīng)圖和等高線(xiàn)可知，在提取時(shí)間一定的條件下，隨著料液比的增加，油樹(shù)脂的得率先逐漸增加后又急劇下降，此時(shí)料液比和乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖的中心點(diǎn)處得到的胡椒油樹(shù)脂得率最大，為16.174%；料液比和乙醇濃度對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率的影響次之，對(duì)胡椒油樹(shù)脂得率影響最小的是乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用，由圖7可知，BC之間的等高線(xiàn)圖形趨于圓形，說(shuō)明其交互作用對(duì)油樹(shù)脂得率影響不大。

根據(jù)圖5的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖來(lái)分析料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)胡椒油樹(shù)脂提取得率的影響。料液比和提取時(shí)間對(duì)油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響最大，顯示為極顯著，其次是乙醇濃度和提取時(shí)間，最后是料液比和乙醇濃度對(duì)油樹(shù)脂中胡椒堿含量的影響。

圖5 因素間的交互作用對(duì)胡椒油樹(shù)脂中胡椒堿含量 影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of factors on the content of piperine in pepper oleoresin

由響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析可知，胡椒油樹(shù)脂得率的最優(yōu)結(jié)果為：料液比1∶30.35 (g/mL)，乙醇濃度75.56%，提取時(shí)間20 min，預(yù)測(cè)的油樹(shù)脂得率為15.6014%，油樹(shù)脂中胡椒堿含量為25.0798%。油樹(shù)脂中胡椒堿含量的最優(yōu)結(jié)果為：料液比1∶30(g/mL)，乙醇濃度76.39%，提取時(shí)間20 min，預(yù)測(cè)的胡椒油樹(shù)脂的得率為15.47%，油樹(shù)脂中胡椒堿含量為25.408%。由響應(yīng)面分析得到的油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量的最優(yōu)組合為：料液比1∶30 (g/mL)，乙醇濃度75.87%，提取時(shí)間20 min，這預(yù)測(cè)結(jié)果為油樹(shù)脂得率15.52%，油樹(shù)脂中胡椒堿含量為25.260%?；趯?shí)驗(yàn)以油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量作為參考指標(biāo)，選擇可以得到較高油樹(shù)脂得率和油樹(shù)脂中胡椒堿含量的優(yōu)化組合，即料液比1∶30 (g/mL)，乙醇濃度75.87%，提取時(shí)間20 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢測(cè)和驗(yàn)證響應(yīng)面的可行性和有效性，選取最優(yōu)的提取條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)，考慮到實(shí)際操作的便利性和局限性，修改最優(yōu)條件為料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度76%、提取時(shí)間20 min，提取的胡椒油樹(shù)脂得率為15.70%，油樹(shù)脂中胡椒堿含量為25.680%，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明曲面響應(yīng)分析所得的模型是準(zhǔn)確可靠的。

3 結(jié)論

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以胡椒鮮果為原料，經(jīng)過(guò)磨漿處理后，用超聲波-微波輔助溶劑提取胡椒鮮果油樹(shù)脂，并用響應(yīng)面優(yōu)化了提取工藝，結(jié)果顯示：對(duì)胡椒鮮果油樹(shù)脂得率影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>乙醇濃度，對(duì)油樹(shù)脂中胡椒堿含量影響大小順序?yàn)橐掖紳舛?提取時(shí)間>料液比。優(yōu)化胡椒鮮果油樹(shù)脂的提取工藝參數(shù)為：料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度76%、提取時(shí)間20 min，提取的胡椒油樹(shù)脂得率為15.70%，油樹(shù)脂中胡椒堿含量為25.680%。超聲波-微波輔助溶劑提取法相對(duì)熱回流提取、溶劑提取等方法而言，可將常規(guī)提取時(shí)間由3～7 h縮短至20 min，在胡椒油樹(shù)脂得率上亦能由10%提高到15.7%。因此，胡椒鮮果可直接用于提取胡椒油樹(shù)脂，不僅減少了曬干工序，節(jié)約了加工周期，而且增加了提取效率，為胡椒鮮果的直接利用和精深加工提供了科學(xué)依據(jù)。