廣藿香PTS基因的克隆及CPEC法構(gòu)建其過表達(dá)載體pRI101-PTS

黃偉展， 胡貞貞 ，盧昌華 ，張宏意,2,3，何夢玲,2,3，嚴(yán)寒靜,2,3

[1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東廣州 510006； 3.中藥材國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站(CARS-21-16)，廣東廣州 510006]

廣藿香來源于唇形科刺蕊草屬植物Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的干燥地上部分，為“十大廣藥”之一，具芳香化濁、和中止嘔、發(fā)表解暑之功效。作為傳統(tǒng)的芳香化濕藥，廣藿香揮發(fā)油具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗感染、抗血栓、抗抑郁等生物活性[1-2]，被作為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要原料。此外，還被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域[3]。廣藿香油的組分多為倍半萜類化合物，數(shù)量超過24 種，其中以廣藿香醇為主要成分[4]。因此，研究廣藿香中倍半萜類化合物生物合成的分子機(jī)理，提高藥材中廣藿香油，尤其是廣藿香醇的產(chǎn)量，對廣藿香藥用資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

廣藿香醇合酶(patchoulol synthase，PTS)是廣藿香中合成廣藿香醇的關(guān)鍵酶，能催化倍半萜的前體法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)DP)生成廣藿香醇等倍半萜類化合物[5]。2006年，Deguerry等[4]從印度廣藿香中成功克隆了PTS基因的cDNA序列。同年， Wu Shuiqin[6]將PTS基因與禽類的法呢基焦磷酸合酶(FPPS，催化合成FDP的酶)基因分別都加入葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，在煙草中實(shí)現(xiàn)FPPS和PTS蛋白重定向，并檢測到轉(zhuǎn)化植株中廣藿香醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5 μg/g(鮮重)。2014年，Hartwig等[7]從印度廣藿香栽培品中克隆了PTS基因的cDNA 序列，發(fā)現(xiàn)與Deguerry克隆的序列存在3.4%的差異。Hartwig將PTS基因cDNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后構(gòu)建到3種pET系列載體上，在3種大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該P(yáng)TS基因變體的表達(dá)產(chǎn)物催化FDP生成的主產(chǎn)物并非廣藿香醇而是大根香葉烯A。這與他們團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果并不相符，通過對PTS蛋白的結(jié)構(gòu)分析，Hartwig發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象很大程度上是由于454和458號(hào)氨基酸的替換造成的?？傮w而言，廣藿香中倍半萜的生物合成的分子機(jī)理研究相對較少，尚未見到該基因在廣藿香中成功過表達(dá)的報(bào)道，隨著對倍半萜類化合物的代謝途徑及調(diào)控機(jī)理的深入研究，對植物體進(jìn)行基因改造，將有望成為提高藥用植物中倍半萜類有效成分合成水平的有效方法[8]。

環(huán)形聚合酶延伸克隆(Circular Polymerase Extension Cloning，CPEC)是一種簡單、有效和經(jīng)濟(jì)的環(huán)狀DNA組裝和克隆方法。CPEC利用具有互補(bǔ)末端的引物，使線性雙鏈DNA片段和載體末端產(chǎn)生重疊序列，然后通過具有末端重疊序列的線性雙鏈DNA片段和載體經(jīng)過變性和退火得到具有重疊末端的單鏈產(chǎn)物。最后彼此互為模板和引物，在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸得到在兩條鏈不同位置分別有兩個(gè)缺口的環(huán)狀載體，重組載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用大腸桿菌體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制得到完整雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒的克隆方法[9-10]。由于該方法對引物Tm值差值要求苛刻，所以引物設(shè)計(jì)過程較繁瑣，目前采用這個(gè)方法構(gòu)建過表達(dá)載體的報(bào)道相對較少。

本研究對海南儋州廣藿香的PTS基因進(jìn)行克隆，采用CPEC法構(gòu)建pRI101-PTS過表達(dá)載體，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為轉(zhuǎn)染廣藿香并進(jìn)一步研究廣藿香的倍半萜生物合成途徑及其調(diào)控表達(dá)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.植株采集自海南儋州，并移栽至廣東藥科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)中藥學(xué)院?？寺【闐H5α、植物表達(dá)載體pRI101-AN均購自TAKARA公司。

1.2 儀器和試劑

TRIpure Reagent(北京艾德萊生物科技有限公司)、FastKing一步法RT-PCR試劑盒、超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒(均購自天根生化有限公司)、瓊脂糖(Biowest公司)、ExRed核酸電泳染料、6×Loading Buffer(莊盟生物)、Recombinant DNase I、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(TAKARA公司)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中PTS基因的CDS 序列(登錄號(hào)AY508730.1、KF983531.1和KP694233.1)，用CloneManager8軟件針對OFR進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

ORF擴(kuò)增引物PTS-F：5′-ATGGAGTTGTATGCC CAAAGTG-3′，PTS-R:5′-TTAATATGGAACAGGGTG AAGGTAC-3′。環(huán)形聚合酶延伸克隆(CPEC)引物PTS-CPEC-F:5′-CTGTTGATAGCCACCATGGAGTTG TATGCC-3′,PTS-CPEC-R:5′-GATTCAGAATTCGGA TCCTTAATATGGAACAGGGTGAAGG- 3′以及pRI101-F:5′-CATACAACTCCATGGTGGCTATCAACAGTGAAG AAC-3′,pRI101-R:5′-CACCCTGTTCCATATTAAGGA TCCGAATTCTGAATCAAC-3′(引物由華大基因合成)。

2 方法

2.1 廣藿香總RNA的提取與PTS基因的克隆

2.1.1 廣藿香總RNA的提取及cDNA的合成 取廣藿香新鮮葉片100 mg，用毛刷除去表面泥沙，加適量的液氮于預(yù)冷的研缽中充分研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至EP管中，提取步驟參照TRIpure Reagent說明書進(jìn)行。提取完成后，用Recombinant DNase I進(jìn)行消化。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 完整性，并用超微量紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度。

在冰浴條件下配制RT-PCR反應(yīng)液：2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，total RNA 3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足50 μL。

PCR 程序?yàn)椋?2 ℃逆轉(zhuǎn)錄3 min，95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的條帶，并測定cDNA的濃度和純度。-20 ℃保存。

2.1.2 PTS基因的T-A克隆 連接轉(zhuǎn)化及菌液PCR加樣過程均在超凈工作臺(tái)完成。在滅菌離心管中配置反應(yīng)液：(2×)RapiLigation Mix 5 μL，pGM-T Fast Vector(50 ng/μL)1 μL，目的PCR片段3 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)T1，復(fù)蘇菌體后取50 μL涂LB平板(Amp 50 mg/L)，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 mg/L)中(以下均簡稱為BL-Amp液體培養(yǎng)基)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)4 h，用引物PTS-F/ R進(jìn)行菌液PCR鑒定。取陽性克隆菌液按100∶1體積比接種至6 mL BL-Amp液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。取1 mL菌液加60%甘油0.5 mL，-80 ℃保存菌種。剩下的5 mL菌液提取重組質(zhì)粒，檢查濃度純度，取適量送華大基因測序，剩余質(zhì)粒于-20 ℃保存。測序結(jié)果用DNAman進(jìn)行序列拼接，并用Blastn進(jìn)行序列比對。

2.2 環(huán)形聚合酶延伸克隆(CPEC)構(gòu)建pRI101-PTS過表達(dá)載體

2.2.1 PTS基因同源臂的引入 PCR反應(yīng)體系：pGM-T-PTS重組質(zhì)粒(160 ng/μL)1 μL，PTS-CPEC-F(10 μmol/L)1.5 μL，PTS-CPEC-R(10 μmol/L)1.5 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，70 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收目的片段，并檢測濃度及純度，備用。

2.2.2 pRI101-AN載體線性化及同源臂的引入 PCR反應(yīng)體系：pRI101-AN載體(200 ng/μL) 1 μL，pRI101-F(10 μmol/L) 1 μL，pRI101-R(10 μmol/L) 1 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，69 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收目的條帶，并檢測濃度及純度，備用。

2.2.3 PTS基因與pRI101-AN線性化載體的環(huán)化PCR反應(yīng)體系 pRI101-AN線性化載體(65 ng/μL)2.5 μL，PTS帶同源臂片段(160 ng/μL) 1.5 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 10 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，75～55 ℃(-0.1 ℃/s)退火，72 ℃延伸6 min，共10個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。為了更方便地進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，不對退火溫度進(jìn)行考察而采用緩慢降溫退火[9]。環(huán)化反應(yīng)完成后，取4 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢視。

2.2.4 環(huán)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5α及陽性克隆驗(yàn)證 取8 μL環(huán)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL DH5α感受態(tài)菌液，轉(zhuǎn)化完成后加入LB液體培養(yǎng)基(無抗性)500 μL，37 ℃、200 r/min復(fù)蘇45 min，4 000 r/min離心2 min，吸取上清100 μL，棄去。剩余部分約100 μL混懸后，取50 μL涂于LB平板(含Kan 50 mg/L)上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

挑取單菌落小量培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(一個(gè)空載樣品作為空白對照)，陽性克隆菌株繼續(xù)小量培養(yǎng)提取質(zhì)粒送測序。測序結(jié)果拼接后與T-A克隆測序結(jié)果比對，同時(shí)確認(rèn)目的片段插入位點(diǎn)是否與預(yù)期一致。

2.2.5 廣藿香PTS基因的生物信息學(xué)分析 利用Clustalw在線軟件將本實(shí)驗(yàn)克隆得到的PTS基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列與GenBank收錄進(jìn)行多序列比對。用Expasy在線分析平臺(tái)對本研究中PTS蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。采用TMHMM 2.0預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1預(yù)測是否含有信號(hào)肽；ProtComp 9預(yù)測其亞細(xì)胞定位。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)使用SOPMA軟件預(yù)測；SMART預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域(PFAM)，SWISS-MODEL基于同源建模方法，構(gòu)建廣藿香PTS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

3 結(jié)果

3.1 廣藿香總RNA的提取及cDNA的合成

測得總RNA OD260/280在1.9左右，瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S條帶清晰，表明得到的總RNA質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。一步法逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢視可見1 500～2 000 bp之間有清晰明亮的條帶(圖1)。初步確定得到廣藿香PTS基因。

圖1cDNA瓊脂糖凝膠電泳
Figure1cDNA agarose gel electrophoresis

3.2 廣藿香PTS基因T-A克隆

構(gòu)建重組T載體完成后，以PTS-F/R引物進(jìn)行菌液PCR，鑒定陽性克隆。陽性菌株提取質(zhì)粒測序，序列拼接后進(jìn)行Blast，結(jié)果表明該序列為PTS基因。

3.3 CPEC法構(gòu)建pRI101-PTS過表達(dá)載體

PTS基因和pRI101-AN載體引入同源臂后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，擴(kuò)增過程都具有較高特異性，兩個(gè)泳道中有且只有1 500～2 000 bp之間以及約10 000 bp處的一條清晰明亮的條帶(圖2)。環(huán)化產(chǎn)物檢視結(jié)果如圖3所示。環(huán)化后在15 000 bp左右能看到一條條帶。轉(zhuǎn)化后的單菌落經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證(引物為PTS-F/R)，均為陽性克隆(圖4)，圖中第7泳道為空白對照(pRI101-AN空載體)。

3.4 廣藿香PTS基因及其編碼的蛋白的生物信息學(xué)分析

PTS基因的cDNA全長為1 659 bp，為一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼552個(gè)氨基酸。用Clustalw在線軟件將本實(shí)驗(yàn)克隆得到的PTS基因的cDNA序列與GenBank收錄的其他產(chǎn)地廣藿香PTS基因的cDNA 序列[登錄號(hào)為AY508730.1(產(chǎn)自印度)、KF983531.1(印度栽培品)和KP694233.1(產(chǎn)自海南萬寧)]進(jìn)行比對分別有50個(gè)、6個(gè)和20個(gè)堿基的差異，差異率為3.01%、0.36%和1.21%。編碼的氨基酸(amino acid，aa)序列(對應(yīng)的登錄號(hào)為AAS86323.1、AHL24448.1、ALQ43502.1)分別有22個(gè)、3個(gè)和12個(gè)氨基酸的差異，差異率3.99%、0.54%和2.17%(圖5)。

注：從左到右依次為DL2000 Marker、PTS、pRI01-AN線性化載體和DL15000 Marker。

圖2PTS基因和pRI101-AN加同源臂后瓊脂糖凝膠電泳檢視圖

Figure2Agarose gel electrophoresis view of PTS gene and pRI101-AN with homology arm

注：從左到右依次為DL2000、CPEC環(huán)化產(chǎn)物和DL15000 Marker。

圖3CPEC產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure3The results of agarose gel electrophoresis of CPEC products

注：Marker為DL2000、第7泳道為空載體空白對照。

圖4菌液PCR驗(yàn)證結(jié)果
Figure4PCR results of bacterial solution

圖5不同產(chǎn)地廣藿香醇合酶氨基酸序列比對圖
Figure5Comparison of patchoulol synthase amino acid sequences in different habitats

PTS基因編碼的蛋白質(zhì)的分子量為64.1 ku，等電點(diǎn)為5.39。在氨基酸組成中，酸性氨基酸(D，E)占15.2%，堿性氨基酸(K，R)占11.8%，極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)占22.3%，疏水氨基酸(L，A，I，F(xiàn)，V，W)占37.5%，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)值為84，正電荷殘基(Arg+Lys)值為65，脂肪系數(shù)為87.61，不穩(wěn)定系數(shù)為42.81，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)則大于10 h。推測其編碼的蛋白可能不穩(wěn)定。ProtScale親疏水性預(yù)測結(jié)果顯示親水性平均值(GRAVY)為-0.289，因此，PTS基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白。TMHMM軟件預(yù)測分析得知，該蛋白無跨膜區(qū)域，全部位于膜外。ProtComp 9軟件綜合預(yù)測結(jié)果表明亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。

根據(jù)PTS基因編碼的蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果如圖6所示，其中C-score代表剪切位點(diǎn)的記分，分值越高表示出現(xiàn)剪切位點(diǎn)的可能性就越大。S-score表示信號(hào)肽記分，Y是基于C和S的綜合記分，通常被視為潛在的剪切位點(diǎn)。從圖6可見，C、S 和 Y 的最高得分分別為0.159、0.135、0.158，均低于0.5，表明PTS蛋白中不具有信號(hào)肽。

軟件SOPMA預(yù)測該氨基酸序列的4種二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7。其中α-螺旋占總氨基酸殘基的70.11%，共有387個(gè)氨基酸參與；延伸鏈有23個(gè)氨基酸參與，占4.17%；16個(gè)參與β-轉(zhuǎn)角占2.90%，無規(guī)則卷曲占22.83%，有126個(gè)氨基酸參與。

用SMART在線軟件預(yù)測PTS基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域(PFAM)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTS基因編碼蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)N末端倍半萜合酶結(jié)構(gòu)域共包含173個(gè)氨基酸殘基，從25～197(aa序列)；一個(gè)C末端倍半萜合酶結(jié)構(gòu)域共包含268個(gè)氨基酸殘基，229～496(aa序列)可能參與線性萜烯的環(huán)化，具結(jié)合鎂離子活性。

采用SWISS-MODEL在線軟件基于同源建模方法，構(gòu)建PTS基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖8)。以蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫相似度較高的(+)-δ-杜松烯合酶序列(相似度44.53%，SMTL ID:3g4d.1.A)為模板蛋白，構(gòu)建PTS基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。GMQE值(Global Model Quality Estimation)為0.75(GMQE評分范圍為0～1，該值反映了模型的準(zhǔn)確度和目標(biāo)覆蓋范圍，數(shù)值越接近1，表示可靠性越高)，QMEAN值(Qualitative Model Energy Analysis)為-2.06(QMEAN評估待測蛋白與模板蛋白的匹配度，值越大表示匹配度越高，大于-4，表示模型可用)，評價(jià)結(jié)果表明該模型可以較好預(yù)測PTS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖6PTS基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測

Figure6Signal peptide prediction of proteins encoded by PTS gene

注：藍(lán)色區(qū)域代表α螺旋，紅色代表延伸鏈，綠色代表β-轉(zhuǎn)角，紫色代表無規(guī)則卷曲。

圖7PTS基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測
Figure7Secondary structure prediction of the protein encoded by the PTS gene

圖8PTS基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

Figure8The tertiary structure prediction of the protein encoded by the PTS gene

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，富含天冬氨酸的DDXXD(D代表天冬氨酸，X代表任意氨基酸)保守區(qū)域被認(rèn)為是參與協(xié)調(diào)金屬陽離子的酶活性中心的組成部分，廣泛存在于萜類合酶中[7,11]，其作用是絡(luò)合金屬陽離子，并有助于將反應(yīng)底物PDF的烴基部分定位在活性口袋內(nèi)，同時(shí)將二磷酸鹽部分保留在外部。本研究對海南儋州、海南萬寧、印度和印度栽培品的PTS蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該DDXXD保守區(qū)域在PTS蛋白中位于第304～308號(hào)氨基酸，且均為DDVYD，見圖8方框部分。

4 討論

4.1 CPEC法構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵因素

本研究設(shè)計(jì)引物時(shí)通過在引物5′端加入插入位點(diǎn)序列，組成重復(fù)序列，重復(fù)區(qū)域長度一般在15～35 nt范圍內(nèi)。相對于重復(fù)序列而言，引物Tm值更具有決定意義。引物重疊區(qū)域的Tm值應(yīng)盡可能的高，理想的Tm值在60～70 ℃之間。因?yàn)镻CR過程中，較高的退火溫度可以保證高水平的特異性擴(kuò)增。除此之外，CPEC法構(gòu)建表達(dá)載體的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于引物的Tm值的差值盡可能控制在2～3 ℃。較小的Tm值差值可以保證CPEC組裝反應(yīng)中，兩個(gè)重疊區(qū)域退火過程的順利進(jìn)行[9]。

環(huán)化組裝過程，反應(yīng)條件可以有兩種選擇，一種是設(shè)置一系列退火溫度進(jìn)行考察，該方法工作量相對較大。因此，本研究采用與降落PCR[12-13]相類似的緩慢降溫退火，由較高的溫度(75 ℃)緩慢降溫過程中實(shí)現(xiàn)插入片段和線性化載體重復(fù)序列的特異性結(jié)合，該過程還大大減少了非特異性擴(kuò)增[9-10]。

由于CPEC特殊的環(huán)化機(jī)制，使得傳統(tǒng)構(gòu)建方法中經(jīng)常出現(xiàn)的載體自連現(xiàn)象基本不會(huì)出現(xiàn)，因此轉(zhuǎn)化感受態(tài)后陽性克隆率相較傳統(tǒng)的酶切連接大大提高。本研究中，轉(zhuǎn)化后平板上得到的單菌落基本都是陽性克隆。

4.2 PTS蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

根據(jù)PTS基因編碼的蛋白，即廣藿香醇合酶的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果提示該蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間不應(yīng)過長，過長可能會(huì)發(fā)生降解而使得蛋白得率降低。此外，該蛋白的pI為5.39，所以在研究其體外活性時(shí)，蛋白提取、純化以及透析使用的緩沖液不應(yīng)在此pH附近，否則會(huì)有部分蛋白析出。

本文結(jié)果顯示，PTS蛋白不含信號(hào)肽，其細(xì)胞定位很可能位于細(xì)胞質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在萜類生物合成途徑中，倍半萜的下游，從前體法呢基焦磷酸(FDP)的合成開始到倍半萜這一部分只發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)[14-16]。這與信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果是相一致的。從結(jié)構(gòu)上看，F(xiàn)DP的碳骨架為鏈狀而廣藿香醇為環(huán)狀，反應(yīng)過程必定涉及碳鏈的環(huán)化，這也與廣藿香醇合酶C末端結(jié)構(gòu)域可能參與線性萜烯的環(huán)化預(yù)測結(jié)果相契合。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)域可能具結(jié)合Mg2+的活性，提示在進(jìn)行體外活性檢測時(shí)，配置緩沖液時(shí)必須加入Mg2+作為活性激活劑。

4.3 PTS基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建對后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)

廣藿香作為“十大廣藥”之一，在醫(yī)藥、化妝品制造等領(lǐng)域占據(jù)著極其重要的地位。其重要化學(xué)成分廣藿香油多為倍半萜類化合物[4]，因此，開展其倍半萜類成分相關(guān)基因的克隆研究以及在原植物中過表達(dá)相關(guān)基因，對廣藿香藥用資源的開發(fā)和應(yīng)用具有重大意義。本研究成功克隆了廣藿香中的PTS基因，并構(gòu)建pRI101-PTS過表達(dá)載體，后續(xù)研究將著眼于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染廣藿香，以求從代謝工程方面著手提高植株中廣藿香醇等倍半萜的含量。同時(shí)，也為探討廣藿香中倍半萜代謝的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。相信隨著對倍半萜類化合物的代謝途徑及調(diào)控機(jī)理的深入研究，對植物體進(jìn)行基因改造，將有望成為提高藥用植物中倍半萜類藥效成分合成水平的有效方法[8,18]，甚至可以通過微生物代謝工程手段，開發(fā)出能合成藥用倍半萜的工程菌[17-18]，更高效便捷地獲取目的產(chǎn)物。