利用CRISPR/Cas9和piggyBac實(shí)現(xiàn)果蠅基因組無縫編輯

王玨，黃娟，許蕊

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利用CRISPR/Cas9和實(shí)現(xiàn)果蠅基因組無縫編輯

王玨，黃娟，許蕊

南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，南京 211166

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是第三代基因組編輯技術(shù)。在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9核酸內(nèi)切酶作用于特定基因組序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，利用同源定向修復(fù)(homology-directed repair, HDR)可實(shí)現(xiàn)對靶基因的特異性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。傳統(tǒng)的技術(shù)方案將CRISPR/Cas9技術(shù)與Cre/loxP或FLP/FRT系統(tǒng)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)高效的基因打靶，也易于移除打靶過程中引入的篩選標(biāo)記。然而，篩選標(biāo)記移除過程中會在基因組中殘留34個堿基的標(biāo)簽序列。因此，對基因組進(jìn)行精確編輯的同時不引入無關(guān)序列仍有一定難度。在人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因組編輯中，CRISPR/Cas9技術(shù)和轉(zhuǎn)座酶聯(lián)用的兩步法策略能夠?qū)崿F(xiàn)這一目標(biāo)：首先運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)，利用同源定向修復(fù)原理引入基因突變及篩選標(biāo)記，然后利用轉(zhuǎn)座酶將篩選標(biāo)記精確移除。借鑒該方法的技術(shù)原理，本研究對果蠅()基因進(jìn)行了無縫編輯(seamless genome editing)，成功將該基因第18外顯子上第21位的酪氨酸(tyrosine, Y)突變?yōu)榘腚装彼?cysteine, C)，且測序結(jié)果顯示基因組中除設(shè)計(jì)位點(diǎn)之外并無其他外源序列殘留。CRISPR/ Cas9技術(shù)和轉(zhuǎn)座酶聯(lián)用策略為果蠅基因組的精確編輯提供了更多選擇。

果蠅；無縫基因組編輯；CRISPR/Cas9；

利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)獲得基因突變體，并檢測基因突變造成的影響是研究基因功能的重要手段。CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated pr-otein 9)技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)基因打靶提供了簡單高效的方法[1~3]。在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9核酸內(nèi)切酶可作用于特定基因序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)，誘發(fā)內(nèi)源性非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源定向修復(fù)(homology-directed repair, HDR)。

非同源末端連接可導(dǎo)致修復(fù)位點(diǎn)產(chǎn)生小片段的DNA插入或缺失，從而造成目標(biāo)基因突變。但是，這類突變具有一定的隨機(jī)性，無法實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的特定編輯。如果在DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中提供外源模板，則在同源定向修復(fù)啟動時可將模板中的特異性突變引入基因組中，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因的特定編輯。然而，同源定向修復(fù)的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非同源末端連接[4]。為了高效篩選到攜帶特異性突變的轉(zhuǎn)基因果蠅()品系，需同時引入篩選標(biāo)記，以便判斷是否發(fā)生了同源定向修復(fù)。篩選標(biāo)記的移除通常利用Cre/loxP或FLP/FRT系統(tǒng)進(jìn)行，但它們都會在基因組中遺留34個堿基的標(biāo)簽序列[5]。如何在對基因組進(jìn)行精確編輯的同時不引入無關(guān)序列，即實(shí)現(xiàn)基因組無縫編輯(seamless genome editing)仍有一定難度。

轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來源于鱗翅目昆蟲，其轉(zhuǎn)座酶識別DNA兩端的特定反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat sequences, ITRs)，并將其插入染色體中TTAA位點(diǎn)[6,7]。該系統(tǒng)簡單高效，早期用在果蠅、蚊子()等昆蟲中獲得轉(zhuǎn)基因品系[8,9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中也具有很高的轉(zhuǎn)座活性[10,11]。除了能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入基因組，轉(zhuǎn)座酶還能夠?qū)в刑囟↖TRs的DNA序列從基因組中精確移除。該系統(tǒng)與CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)用，能夠用來移除在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)基因組編輯中引入的藥物篩選標(biāo)記或核酸酶，且不遺留任何外源核酸序列，實(shí)現(xiàn)基因組無縫編輯[12,13]。

果蠅基因位于2號染色體左臂，其編碼的Ca-α1D蛋白是L型電壓門控鈣離子通道(voltage- gating calcium channel, VGCC)的重要組成亞基，參與肌肉收縮、神經(jīng)重塑、上皮液轉(zhuǎn)運(yùn)等一系列重要的生命過程[14~17]。研究Ca-α1D蛋白，尤其是其特定結(jié)構(gòu)域的功能對揭示電壓門控鈣離子通道的生理功能具有重要意義。

本研究以果蠅為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將基因第18個外顯子上第21位酪氨酸(tyrosine, Y)突變?yōu)榘腚装彼?cysteine, C)，且沒有引入任何外源序列。本研究應(yīng)用的基因打靶策略為果蠅基因組的精確編輯提供了更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型果蠅w、平衡染色體品系和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)品系BL#8284均來自于Bloomington果蠅庫，BL#8284果蠅品系2號染色體攜帶并與標(biāo)記相偶聯(lián)，可內(nèi)源性表達(dá)轉(zhuǎn)座酶。Nos-Cas9(3rdchr)果蠅品系為本實(shí)驗(yàn)室果蠅庫所有，該品系3號染色體attP2位置插入了基因，胚胎細(xì)胞能夠內(nèi)源性表達(dá)Cas9核酸內(nèi)切酶。U6b-sgRNA-short載體由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院倪建泉實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[18]，pGX-attP載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[19]。

1.2 果蠅基因組測序

在Flybase數(shù)據(jù)庫中查詢基因序列信息，設(shè)計(jì)引物對Nos-Cas9(3rdchr)果蠅品系基因第18外顯子(長度為108 bp)上下游各約300 bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序(引物序列見表1)，擴(kuò)增片段大小為700 bp，經(jīng)測序，結(jié)果表明序列與Flybase數(shù)據(jù)庫中相同。這一步驟的目的是確保sgRNA能順利與基因組中相應(yīng)序列匹配，并正確引導(dǎo)Cas9切割靶序列。由于基因內(nèi)含子區(qū)域常存在比較大的變異性，當(dāng)sgRNA序列位于內(nèi)含子區(qū)域時，這一步尤為重要。

1.3 sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

首先在目標(biāo)突變位點(diǎn)附近尋找?guī)в蠵AM (pro-tospacer adjacent motif)的序列作為sgRNA序列，將對應(yīng)序列(5′-CACCAACATGATATTACCAA-3′)在果蠅CRISPR網(wǎng)站(http://flycrispr.molbio.wisc.edu)上檢測，沒有發(fā)現(xiàn)可能的脫靶序列。根據(jù)sgRNA序列設(shè)計(jì)2條5′端分別帶有TTCG和AAAC序列的互補(bǔ)引物FW2和RV2 (序列見表1)。將2種引物分別配制成100 μmol/L溶液，各取10 μL，加入2.5 μL 10×的T4 DNA連接酶緩沖液，并補(bǔ)水2.5 μL至終體積25 μL，在PCR儀上復(fù)性(復(fù)性條件為100℃ 10 min，之后每分鐘溫度降1℃至最終溫度25℃)形成5′末端帶有粘性末端的雙鏈DNA片段，通過T4 DNA連接酶(NEB公司，美國)連接在經(jīng)Ⅰ酶切后回收的載體U6b-sgRNA-short上，獲得sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，方法見參考文獻(xiàn)[20]。

1.4 供體DNA質(zhì)粒構(gòu)建

將pGX-attP載體(載體詳情見參考文獻(xiàn)[19])上兩個多克隆位點(diǎn)之間的(從65Ⅰ位點(diǎn)至Ⅰ位點(diǎn))替換為兩端帶有轉(zhuǎn)座酶識別位點(diǎn)ITRs的標(biāo)記基因，獲得載體pGX- DsRed。在目標(biāo)突變位點(diǎn)附近尋找TTAA位點(diǎn)作為標(biāo)記基因插入位置，在此序列前后各約1.2 kb和1.1 kb分別設(shè)計(jì)5′同源臂和3′同源臂，同源臂擴(kuò)增使用的PCR酶為Phanta高保真酶(南京諾唯贊公司)。擴(kuò)增5′同源臂的引物為FW3、RV3、FW4和RV4(序列見表1)，為了引入突變堿基，本研究將5′同源臂分成2部分進(jìn)行擴(kuò)增。由于供體DNA質(zhì)粒中包含sgRNA序列，為防止供體質(zhì)粒注入果蠅胚胎后被Cas9切割，本研究對這部分序列中的3個氨基酸進(jìn)行了同義突變(GGT→GGA，AAT→AAC，ATC→ ATT)，同時擴(kuò)增過程中還在FW3引物中引入了點(diǎn)突變(TAT→TGT)，編碼氨基酸由酪氨酸變成半胱氨酸。3′同源臂擴(kuò)增引物為FW4和RV4(序列見表1)。為保證標(biāo)記在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中順利移除，5′同源臂的3′端和3′同源臂的5′端均帶有TTAA序列，這樣經(jīng)轉(zhuǎn)座酶處理后才能得到無縫效果。擴(kuò)增得到的片段使用多片段同源重組酶(南京諾唯贊公司)進(jìn)行連接。

表1 引物序列信息

斜體下劃線分別為酶切位點(diǎn)RⅠ和65Ⅰ序列，僅下劃線為同義突變堿基，粗體下劃線為點(diǎn)突變堿基，粗體為TTAA序列。

1.5 基因敲入果蠅突變體的獲得

取sgRNA表達(dá)質(zhì)粒5 μg、供體DNA質(zhì)粒10 μg，混合后用酚/氯仿抽提純化，并用20 μL注射緩沖液(5 mmol/L氯化鉀，0.1 mmol/L磷酸鈉，pH 6.8)溶解質(zhì)粒，使sgRNA質(zhì)粒和供體DNA質(zhì)粒終濃度分別為250 ng/μL和500 ng/μL。收集Nos-Cas9(3rdchr)果蠅胚胎進(jìn)行顯微注射，孵化出的雌蠅和雄蠅分別與w的雄蠅和處女蠅雜交，篩選后代攜帶紅色熒光標(biāo)記的果蠅，并與平衡染色體品系雜交。對篩選到的轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行鑒定時，分別在基因組和插入的標(biāo)記基因上設(shè)計(jì)引物用于跨同源臂PCR鑒定?？?′同源臂PCR產(chǎn)物大小約為1.8 kb，上游引物FW6位于基因組5′同源臂上游，下游引物RV6位于基因近5′端；跨3′同源臂PCR產(chǎn)物大小約為1.2 kb，上游引物FW7位于基因組3′同源臂上游，下游引物RV7位于基因近3′端。引物序列見表1。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認(rèn)擴(kuò)增條帶大小是否正確。

1.6 篩選標(biāo)記基因的切除

將鑒定正確的轉(zhuǎn)基因果蠅品系與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的果蠅品系BL#8284雜交，在雜交后代中挑選基因型為[DsRed]*的雜合子，該基因型的雜合子部分細(xì)胞中的標(biāo)記被轉(zhuǎn)座酶切除而顯示出鑲嵌表型，可通過觀察復(fù)眼的鑲嵌型紅色熒光表型挑選該基因型的果蠅，并根據(jù)復(fù)眼中紅色熒光存留比例估算大致移除效率。將該雜合子與平衡染色體品系雜交，在后代中挑選不帶標(biāo)記且?guī)в袠?biāo)記的果蠅，并與平衡染色體品系雜交，并使其純合。提取純合果蠅基因組DNA，對基因第18個外顯子附近進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，確定純合品系是否攜帶點(diǎn)突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 CG4894敲入突變體的獲得及鑒定

本研究通過查詢Flybase數(shù)據(jù)庫獲得基因序列，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)氨基酸—酪氨酸位于第18外顯子第21位，此外顯子為轉(zhuǎn)錄本C、E、H和J共有，其序列見圖1A (大寫粗體部分)。本研究通過PCR擴(kuò)增及測序，驗(yàn)證了第18外顯子上下游約300 bp的序列與數(shù)據(jù)庫中查詢序列相同，在目標(biāo)氨基酸附近選取合適的sgRNA序列和TTAA序列。

在構(gòu)建供體DNA質(zhì)粒時，本研究以目標(biāo)突變位點(diǎn)附近的TTAA序列為界，分別選取TTAA上游1.2 kb序列作為5′同源臂，TTAA下游1.1 kb序列作為3′同源臂。由于5′同源臂包含了sgRNA序列，為防止Cas9剪切，本研究將sgRNA序列中3個氨基酸進(jìn)行了同義突變。5′同源臂分為2個部分進(jìn)行擴(kuò)增，并通過引物引入sgRNA中的同義突變和21位氨基酸的點(diǎn)突變(圖1B)，成功進(jìn)行同源重組后兩端帶有ITRs的基因被插入基因組TTAA位置。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)座酶可將2個TTAA之間的標(biāo)記移除，恢復(fù)為原基因組中的1個TTAA序列，實(shí)現(xiàn)基因組的無縫編輯。

將sgRNA質(zhì)粒和供體DNA質(zhì)?；旌衔镒⑷爰s1000個Nos-Cas9(3rdchr)果蠅胚胎中，最終得到257只雄蠅和240只雌蠅，注射成活率為49.7%。這些雄蠅和雌蠅分別和w處女蠅、雄蠅進(jìn)行雜交，后代經(jīng)過紅色熒光篩選，獲得3個攜帶篩選標(biāo)記的果蠅品系。雜交實(shí)驗(yàn)表明，3個品系中標(biāo)記均位于目標(biāo)基因所在的2號染色體上，其編號分別為1-1、5-1和5-2。此外，如果發(fā)生了同源重組，利用FW6、RV6引物擴(kuò)增可得到1.8 kb大小、跨5′同源臂的PCR產(chǎn)物，利用FW7、RV7引物擴(kuò)增可得到1.2 kb大小、跨3′同源臂的PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示3個品系的基因組DNA均能擴(kuò)增得到預(yù)期大小的條帶，證實(shí)本研究已成功構(gòu)建了敲入突變體(圖1C)。

圖1 基因敲入突變體的設(shè)計(jì)及鑒定

A：基因轉(zhuǎn)錄本第18外顯子示意圖。下方為基因轉(zhuǎn)錄本示意圖(引自Flybase數(shù)據(jù)庫)，方框標(biāo)記表示部分轉(zhuǎn)錄本C、E、H和J共有的第18外顯子，上方為這一外顯子及其上下游序列，陰影部分為目標(biāo)突變位點(diǎn)，實(shí)線下劃線為TTAA序列，虛線下劃線為sgRNA序列，加點(diǎn)CCA為PAM序列；B：基因點(diǎn)突變體構(gòu)建示意圖。三角形標(biāo)記為基因組中目標(biāo)點(diǎn)突變位置，五角星標(biāo)記為供體DNA質(zhì)粒攜帶的點(diǎn)突變，sgRNA*表示供體DNA質(zhì)粒上的sgRNA攜帶同義突變；C：基因敲入果蠅跨同源臂PCR鑒定結(jié)果。M：100 bp DNA maker；1-1、5-1、5-2為攜帶篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因果蠅品系；WT：野生型果蠅。

2.2 DsRed熒光標(biāo)記的去除和鑒定

為了移除上述基因敲入品系中的篩選標(biāo)記，本研究通過雜交方式引入轉(zhuǎn)座酶。BL#8284果蠅品系2號染色體上帶有由hsp70啟動子驅(qū)動表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶，將這一品系與帶有標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因品系雜交，后代基因型為[DsRed]*的雜合體表現(xiàn)出鑲嵌表型，即部分細(xì)胞中標(biāo)記被轉(zhuǎn)座酶切除，且紅色熒光存留比例取決于的表達(dá)和剪切效率。本研究雜合體果蠅復(fù)眼中約有50%的小眼無紅色熒光，據(jù)此估算轉(zhuǎn)座酶的切除效率大概為50%左右。將鑲嵌表型果蠅與平衡系果蠅雜交，后代出現(xiàn)的無紅色熒光果蠅(圖2A)與平衡染色體品系雜交，并使其純合。3個品系中攜帶篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因果蠅1-1、5-1和5-2經(jīng)過雜交，均獲得了不攜帶熒光標(biāo)記的白眼點(diǎn)突變純合果蠅，這些品系未出現(xiàn)明顯表型。

理論上，同源重組可以發(fā)生在同源臂的任意位置。在本研究中，如果同源重組發(fā)生在突變位點(diǎn)和TTAA之間，則突變不被引入基因組。因此，本研究對獲得的白眼點(diǎn)突變純合果蠅品系進(jìn)行了測序，驗(yàn)證突變是否引入。測序結(jié)果表明，3個品系中均存在Y→C突變及sgRNA部分的同義突變(圖2B)，且TTAA位點(diǎn)附近沒有引入任何突變和外源序列(圖2C)。

綜上所述，本研究成功在果蠅基因中引入了點(diǎn)突變，并且沒有任何外源序列遺留，證實(shí)了CRISPR/Cas9和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)聯(lián)用策略用于果蠅基因組精確編輯的可行性。

3 討論

基因組編輯技術(shù)能夠精確地實(shí)現(xiàn)生物體基因組定點(diǎn)突變、插入或敲除，人為改變生物遺傳信息。20世紀(jì)末人們就開始對基因編輯技術(shù)進(jìn)行探索，從第一代DNA核酸酶編輯系統(tǒng)ZFN (zinc finger nuclease)、第二代TALEN (transcription activator-like effector nuclease)到第三代CRISPR/Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高、成本逐漸降低，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大[21]。近幾年CRISPR/Cas9技術(shù)的迅速發(fā)展，及其在各種模式生物中的廣泛應(yīng)用，使得突變體的獲得變得更加簡單高效。與此同時，人們對突變體的特異性也提出了越來越高的要求。如前所述，NHEJ容易引起隨機(jī)插入和缺失，它導(dǎo)致的突變帶有很大的隨機(jī)性，想要獲得“設(shè)計(jì)”的突變必須通過同源定向修復(fù)。但在這一策略中，提高突變體篩選的效率和不引入無關(guān)序列就成了一對矛盾，這一矛盾在果蠅中尤為突出。由于果蠅體型較小，無法使用部分身體組織提取DNA，只能在子代產(chǎn)出之后再將親本處死，提取DNA進(jìn)行基因型鑒定，因此在果蠅基因編輯過程中多引入各種篩選標(biāo)記，通過對后代進(jìn)行表型篩選提高突變體的篩選效率。

圖2 標(biāo)記基因的去除和點(diǎn)突變體的測序鑒定

A：去除標(biāo)記基因的雜交流程。星號表示部分標(biāo)記基因移除；B：野生型果蠅和基因點(diǎn)突變體在目標(biāo)突變位點(diǎn)處的序列比較。五角星標(biāo)記表示目標(biāo)突變位點(diǎn)，星號表示同義突變位點(diǎn)；C：野生型果蠅和基因點(diǎn)突變體在TTAA位點(diǎn)處的序列比較。WT：野生型果蠅；1-1、5-1、5-2為白眼點(diǎn)突變純合果蠅品系。

圖3 3種基因組編輯策略的比較

A：介導(dǎo)的基因組無縫編輯。標(biāo)記基因兩端帶有轉(zhuǎn)座酶特異識別序列(ITRs)，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組使其隨著突變插入染色體TTAA位點(diǎn)，后經(jīng)轉(zhuǎn)座酶切除，只在染色體中保留突變；B：單鏈退火(single-strand annealing, SSA)介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)。兩條同源臂在基因組中有重疊，因此第一次同源重組導(dǎo)致染色體上攜帶重復(fù)片段，且重復(fù)片段位于標(biāo)記基因兩端，再次利用CRISPR/Cas9制造染色體斷裂可以誘導(dǎo)染色體內(nèi)同源重組的發(fā)生，將標(biāo)記基因去除；C：通過兩步同源重組實(shí)現(xiàn)的無縫基因置換。第一次同源重組將目標(biāo)基因替換為標(biāo)記基因，第二次同源重組將標(biāo)記基因替換為帶有突變的目標(biāo)基因。其中，目標(biāo)基因兩端可以攜帶不同于基因組剪切所用的sgRNA序列，以保證Cas9不會作用于同源臂載體。圖根據(jù)文獻(xiàn)[13,22,23]修改繪制，三角形標(biāo)記表示基因組中目標(biāo)點(diǎn)突變位置，五角星標(biāo)記表示供體DNA質(zhì)粒攜帶的點(diǎn)突變。

為了精確去除篩選標(biāo)記，在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的基因組編輯中，轉(zhuǎn)座酶被嘗試用于去除基因編輯過程中引入的藥物篩選標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)基因無縫編輯，并獲得了成功(圖3A)。除此以外，還有2種策略已被報(bào)道。單鏈退火(single-strand annealing, SSA)介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)(SSA-mediated DNA double-strand break repair)[22]在HEK293T細(xì)胞基因編輯過程中得到應(yīng)用，該策略是在同源重組階段通過帶有重疊的同源臂引入染色體內(nèi)重復(fù)，然后介導(dǎo)染色體內(nèi)同源重組將標(biāo)記基因去除(圖3B)。兩步同源重組實(shí)現(xiàn)的無縫基因置換[23]被用于果蠅基因的編輯，該策略利用第一次同源重組將目標(biāo)基因替換為標(biāo)記基因，再利用第二次同源重組將標(biāo)記基因替換為突變后基因(圖3C)。但這兩種方法與轉(zhuǎn)座酶法相比，篩選標(biāo)記的去除都需通過同源重組，因此稍顯復(fù)雜。

轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)簡單高效，不需二次基因打靶就能將標(biāo)記基因精確切除。而且，由于這一系統(tǒng)早就用于果蠅的基因編輯，果蠅中已發(fā)展了一系列相關(guān)工具，如本研究中用到的內(nèi)源表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的果蠅品系。這一品系使得標(biāo)記基因的去除可以通過簡單的雜交進(jìn)行，而不像其他系統(tǒng)，需要通過注射或其他復(fù)雜操作將轉(zhuǎn)座酶引入突變體。當(dāng)然，該系統(tǒng)對基因序列有一定要求，標(biāo)記基因需要插入內(nèi)源的TTAA序列，如果其距離目標(biāo)突變位點(diǎn)較遠(yuǎn)則會降低突變引入的效率。理論上，TTAA在基因組中出現(xiàn)的概率為1/256，由于TTAA只需在目標(biāo)區(qū)段附近即可，因而不難找到。

綜上所述，CRISPR/Cas9和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)聯(lián)用策略在果蠅中的可行性為果蠅基因組的精確編輯提供了更多選擇。

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Seamless genome editing inby combining CRISPR/Cas9 andtechnologies

Jue Wang, Juan Huang, Rui Xu

The typeⅡ CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR- associated protein 9) is an efficient RNA-guided genome-editing technique. Guided by sgRNA, the Cas9 endonuclease generates site-specific double-stranded breaks (DSB) at specific site, which is amenable to repair by homology-directed repair (HDR) to generate a designed knock-out or knock-in transgene. In combination with CRISPR/Cas9 and Cre/loxP or FLP/FRT system, efficient gene targeting can be achieved, and meanwhile screening markers introduced can be readily removed except a 34-base pair residual fragment. Thus, difficulties remain in accurate editing of the genome without introducing any extraneous sequences. In human induced pluripotent stem cells (iPSCs), a two-step strategy has been developed using CRISPR/Cas9 and thesystem to establish a seamless genomic editing, in which CRISPR/Cas9 is initially used to introduce mutations along with screening markers by HDR, then the markers are precisely excised bytransposase. Using this strategy, we have successfully transformed the tyrosine to cysteine at position 21 within the 18th exon of thegene in thegenome without introducing any extraneous sequence. Hence, this strategy provides more options for precise and seamless editing of thegenome.

; seamless genome editing; CRISPR/Cas9;

2018-12-27;

2019-01-31

南京醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)人才啟動經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(編號：2012RC04)資助[Supported by the Start-up Foundation from Nanjing Medical University (No. 2012RC04)]

王玨，本科，專業(yè)方向：果蠅基因打靶技術(shù)。E-mail: 15651972835@163.com

許蕊，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：果蠅基因打靶技術(shù)。E-mail: xurui20062624@163.com

10.16288/j.yczz.18-345

2019/3/29 13:36:20

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190329.1335.002.html

(責(zé)任編委: 張雷)