利用蛋白組學(xué)和化學(xué)計量學(xué)區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦

胡玲萍，張鴻偉,，張 峰，林 超，薛長湖,*，張曉梅,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.山東出入境檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）又稱東方對蝦，隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、對蝦科、對蝦屬，是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類之一[1]。中國對蝦主要分布于我國黃海和渤海海域[2]，不僅產(chǎn)量豐富，而且具有營養(yǎng)價值高、保健功能強等特點，深受廣大消費者的青睞[3-5]。中國對蝦是中國和朝鮮半島重要的水產(chǎn)品之一[6]，同時也是我國蝦類出口的主要產(chǎn)品[7]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，中國對蝦發(fā)揮著越來越重要的作用。但是養(yǎng)殖和海捕的中國對蝦在風(fēng)味、口感和商業(yè)價值上存在一定差異。海捕中國對蝦較養(yǎng)殖中國對蝦鮮味濃，口感也有所不同[8]。海捕中國對蝦的價格也明顯高于養(yǎng)殖中國對蝦的價格，為謀求利益，養(yǎng)殖對蝦代替海捕對蝦的現(xiàn)象時常發(fā)生[9-10]。因此有必要開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的方法。

目前，國內(nèi)外已有一些用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖對蝦的方法。20世紀(jì)80年代研究者以感官方法和解剖對比區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦[11]，但對于普通消費者來說很難通過感官方法區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。林洪等[12]研究表明肌動球蛋白溶解度、ATPase活性、疏水性可作為鑒別海捕對蝦和養(yǎng)殖對蝦的指標(biāo)。薛長湖等[13]研究表明對蝦肌肉蒸煮后的失水率和脂肪酸中C18:2ω6含量可用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦。Ortea等[14]通過砷、鉛、鉻等重金屬等多元統(tǒng)計分析區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的對蝦。Kim等[15]利用穩(wěn)定性同位素性δ13C和δ15N區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的對蝦。

與上述方法相比，以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)方法在穩(wěn)健性、靈敏度、選擇性、多路復(fù)用和高通量方面具有明顯的優(yōu)勢，迅速發(fā)展成為一種強有力的食品認(rèn)證工具，這一點從不斷增加的物種識別、食品摻假和食品生產(chǎn)方法（野生/養(yǎng)殖）的研究中得到證明[16-19]。到目前為止，使用蛋白組學(xué)方法區(qū)分海捕和養(yǎng)殖對蝦的研究仍然受限。但隨著定量蛋白組學(xué)和質(zhì)譜的發(fā)展，采集所有理論碎片離子（sequential window acquisition of all theoretical fragment ions，SWATH）技術(shù)應(yīng)運而生。SWATH蛋白組學(xué)技術(shù)作為一種無標(biāo)記的蛋白定量方法，可以同時對上千種蛋白進行平行量化[20]，為復(fù)雜食品中蛋白定量提供更高的精確度和重現(xiàn)性[21-22]。由于組學(xué)研究通常涉及大量的樣本和變量，因此有必要采用化學(xué)計量學(xué)方法提取有效信息并建立樣本之間的關(guān)系[23]。

本研究以超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q TOF-MS）為分析工具，運用比較定量蛋白組學(xué)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)尋找區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物，為區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國對蝦由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供，經(jīng)鑒定為中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）。

測序級胰蛋白酶（比活力18 523 U/mg） 美國Promega公司；質(zhì)譜級甲酸（純度＞98%） 瑞士Fluka公司；乙腈 美國Fisher公司；碘代乙酰胺 美國Sigma公司；二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、鹽酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX Triple TOF? 5600 MS儀 美國SCIEX公司；Nexera X2 30A UPLC儀 日本島津公司；MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 中國對蝦蛋白提取和酶解

海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦分別取6 個完整個體，用分析磨床在液氮浴中研磨成粉末。各取1 g研磨成粉末的樣品，分別用10 mL蛋白提取液（8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3溶液），垂直振蕩30 min提取蛋白，高速低溫離心20 min（4 ℃、15 000 r/min）。參考Wi?niewski[24]和Mi Rui[25]等方法，各取上清液100 μL，分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇在60 ℃反應(yīng)1 h。取5 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺，加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1 h，實驗重復(fù)3 次。采用10 kDa截留分子質(zhì)量超濾離心管在15 000 r/min離心超濾20 min后，每次用200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液洗滌膜上層蛋白，共洗滌3 次。最后在膜上層加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液作為緩沖液并按酶和底物比1∶50將胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中，混勻并37 ℃酶解16 h，使酶解徹底。超濾離心管15 000 r/min離心超濾20 min，收集下層的肽段濾液。

1.3.2 UPLC條件

色譜柱：安捷倫AdvanceBio Peptide Map column（150 mm×2.1 mm，130 ?，2.7 μm）；柱溫：40 ℃。流動相A：0.1%甲酸-乙腈，流動相B：0.1%甲酸溶液；流速：0.25 mL/min；進樣量：30 μL；進樣時間：46 min；流動相梯度：0～2 min（95% B），2～17 min（95%～80% B），27～37 min（85%～65% B），37～39 min（65%～20% B），39～42 min（20%～95% B），42～46 min（95% B）。

1.3.3 MS條件

采用正離子模式，噴霧電壓5 500 V，電子電離源，掃描范圍350～1 500 Da，正離子反應(yīng)模式，霧化氣GS1 35 psi，輔助加熱器GS2 45 psi，氣簾氣壓35 psi，噴霧電壓5 500 eV，離子源溫度500 ℃，解簇電壓100 V，碰撞能量10 eV，信號強度閾值2×104。

樣品SWATH采集：建立SWATH采集方法。在DDA模式下，在m/z 400～1 250范圍內(nèi)對混合多肽進行數(shù)據(jù)采集，3 次平行實驗，PeakView 2.0處理獲得子離子m/z和信號強度后，SWATH可變窗口計算器計算SWATH-MS動態(tài)采集窗口大小。其參數(shù)設(shè)置：目標(biāo)窗口數(shù)量60 個，最小m/z 400，最大m/z 1 250，窗口重疊1 Da，CES 15，計算得數(shù)據(jù)采集系列窗口。高靈敏度模式下采集MS2譜圖，用SWATH-MSALL方法對海捕和養(yǎng)殖中國對蝦肽段樣品在m/z 400～1 250范圍進行SWATH數(shù)據(jù)采集，每組設(shè)置6 個生物學(xué)重復(fù)，每一樣品重復(fù)采集SWATH數(shù)據(jù)2 次，采用隨機數(shù)進樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用ProteinPilotTM軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，選用NCBI的中國對蝦數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索。ProteinPilot軟件參數(shù)設(shè)置如下：搜庫方法：Paragon method；酶切：胰蛋白酶；儀器：TripleTOF 5600；物種：無；ID Focus：Amino acid Subtitutions，Biological modifications；檢索類型：ID；檢測蛋白質(zhì)閾值（Unused Protscore（conf））：大于0.05%（10.0%）；提交錯誤發(fā)現(xiàn)率分析報告。

用PeakView和SWATH Micro App對采集的海捕和養(yǎng)殖中國對蝦SWATH數(shù)據(jù)進行處理，對保留時間進行校正后，從鑒定蛋白庫中提取可被SWATH定量的蛋白及其對應(yīng)的肽段和碎片離子信息。SWATH數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置：每一蛋白至少6 條可定量多肽，每一多肽至少6 個碎片離子。

用MarkerViewTM軟件對樣品進行歸一化處理，設(shè)置：最小保留時間2 min，最大保留時間40 min；設(shè)置數(shù)據(jù)組的分類標(biāo)志。

用SMICA軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），選取Pareto方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-Q TOF-MS結(jié)果

圖 1 中國對蝦有代表性的總離子流色譜圖Fig. 1 Representative total ion chromatogram (TIC) of F. chinensis

SWAHT-MS可采用穩(wěn)健和完整的方式進行比較定量分析[26]。對海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦樣本進行UPLC-Q TOF-MS檢測，未見異常的總離子流色譜圖。從圖1可以看出，譜峰比較尖銳，峰形較為對稱，樣本的保留時間重現(xiàn)性好，分析系統(tǒng)穩(wěn)定性好，為后續(xù)分析打下良好的基礎(chǔ)。

2.2 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白鑒定結(jié)果

使用ProteinPilotTM軟件對得到的MS數(shù)據(jù)用中國對蝦NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索，共鑒定52 個蛋白、2 081 條肽段和14 775 個碎片。將檢索得到的庫作為數(shù)據(jù)庫，并在PeakView軟件將SWATH數(shù)據(jù)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫，按照1.4節(jié)的參數(shù)設(shè)置進行處理，并進行手工校正，最終保留35 個可相對定量的蛋白。

2.3 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的PCA和OPLS-DA

從圖2A可以看出，海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦分居X軸的正半軸和負半軸，在t[1]上明顯分離，且組間差異較大，組內(nèi)差異較小。雖然樣品點略顯分散，但總體上可以很好地對2 個樣品進行區(qū)分。從圖2B可以看出，相比于PCA，OPLS-DA中樣品點在X軸上的分布更加緊密，所以兩兩比較有監(jiān)督的OPLS-DA可以更好地對海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦樣品進行區(qū)分。

2.4 海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦蛋白生物標(biāo)志物的篩選結(jié)果

為進一步明確海捕和養(yǎng)殖中國對蝦間具有統(tǒng)計學(xué)差異的蛋白，找到區(qū)分2 種不同來源中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物，利用以上建立的兩兩有監(jiān)督的OPLS-DA模型進行識別。圖3A為OPLS-DA模型對應(yīng)的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）圖，VIP值大于1可被認(rèn)為是潛在生物標(biāo)志物[27]。圖3B為OPLS-DA模型對應(yīng)的S圖（S-plot），采用離原點越遠表示對分類貢獻越大的原則[28]，選相關(guān)性p（corr）的絕對值大于0.8，尋找對樣本分類具有重要貢獻的蛋白生物標(biāo)志物信息。圖3C為OPLS-DA模型的因子載荷圖，篩選標(biāo)準(zhǔn)為其Jack-knifed置信區(qū)間不應(yīng)跨越0值[29-30]。通過篩選，共得到8 個候選的蛋白生物標(biāo)志物，分別為肌動蛋白1、精氨酸激酶、β-肌動蛋白、血藍蛋白、卵黃蛋白原、血藍蛋白，部分、果糖1,6-二磷酸醛縮酶A和激活轉(zhuǎn)錄因子-2。

圖 3 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物的篩選Fig. 3 Screening for protein biomarkers of wild and farmed F. chinensis

此外，對海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的各個蛋白進行統(tǒng)計學(xué)分析（表1），P值小于0.05的具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，在具有統(tǒng)計學(xué)差異的前提下，選取差異倍數(shù)大于1.2或者小于0.83的蛋白，作為最終的蛋白生物標(biāo)志物。在排除精氨酸激酶、β-肌動蛋白、果糖1,6-二磷酸醛縮酶A后，肌動蛋白1、血藍蛋白、卵黃蛋白原、血藍蛋白，部分、激活轉(zhuǎn)錄因子-2被篩選為最終的蛋白生物標(biāo)志物，用于區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。

表 1 海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦統(tǒng)計分析Table 1 Statistical analysis of wild and farmed F. chinensis

2.5 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦層次聚類分析

圖 4 海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的層次聚類熱力圖Fig. 4 Hierarchical cluster analysis and heatmap of wild and farmed F. chinensis

圖4為海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦通過蛋白生物標(biāo)志物篩選所得的層次聚類熱力圖（6 個平行實驗，每個樣品重復(fù)2 次），圖中每個小方格代表該蛋白在該樣品中的豐度，小方格的顏色越紅表明蛋白豐度越大，顏色越綠表明蛋白豐度越小。從圖4可以看出，海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦被分為2 個分支，說明通過篩選得到蛋白的生物標(biāo)志物可以很好地區(qū)分這2 個樣品。

3 結(jié) 論

本研究使用UPLC-Q TOF-MS SWATH技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)，比較定量分析海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白含量。并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法尋找生物標(biāo)志物。OPLS-DA結(jié)果顯示，該方法可以化復(fù)雜為簡單，有效提取復(fù)雜變量間的主要信息，降低分析難度，并揭示海捕和養(yǎng)殖中國對蝦樣本之間蛋白豐度的差異。層次聚類分析表明，化學(xué)計量學(xué)篩選所得的生物標(biāo)志物可以很好地區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦。與傳統(tǒng)方法相比，本方法靈敏度更高、精確度更好。

本研究找到了區(qū)分海捕和養(yǎng)殖中國對蝦的蛋白生物標(biāo)志物，為區(qū)分海捕和養(yǎng)殖的中國對蝦提供一種新的研究思路。該思路也可應(yīng)用到其他食品的真實性分析、產(chǎn)地溯源、物種鑒定等領(lǐng)域，為分析高度同源的蛋白質(zhì)食品提供一定的參考價值。