結(jié)合線粒體D-loop序列和SSR標(biāo)記對寶石鱸養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的分析

趙立祥，董浚鍵，孫成飛，田園園，胡 婕，盧邁新，葉 星

(1.農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510381；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

寶石鱸(Scortumbarcoo)學(xué)名高體革鯻，隸屬于鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)鯻科(Teraponidae)革鯻屬(Scortum)，自然分布于澳洲河流，是澳大利亞重要的游釣魚類。上世紀(jì)90年代中國山東、廣東等地陸續(xù)寶石鱸，因其肉質(zhì)細(xì)膩、無肌間刺且生長速度較快等而深受消費(fèi)者喜愛，現(xiàn)正成為中國淡水工業(yè)化養(yǎng)殖與池塘養(yǎng)殖的品種[1]。由于近年來養(yǎng)殖寶石鱸出現(xiàn)生長速度下降與病害頻發(fā)的問題，嚴(yán)重影響寶石鱸的養(yǎng)殖效益，也危及產(chǎn)品的質(zhì)量安全。目前，關(guān)于寶石鱸的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析、養(yǎng)殖技術(shù)、雜交育種和病原病害等領(lǐng)域，針對寶石鱸種質(zhì)遺傳變異未有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，有必要開展寶石鱸養(yǎng)殖種群種質(zhì)情況調(diào)查，了解其遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，綜合采用線粒體D-loop序列及SSR標(biāo)記分析對4個(gè)廣東地方養(yǎng)殖種群的遺傳多樣性及種群間的分化進(jìn)行分析，以期為寶石鱸的改良育種與苗種培育工作提供理論依據(jù)。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，廣義上它是指地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和，表現(xiàn)為多層次、多水平，遺傳多樣性不僅包括變異水平的高低，也包括變異的分布格局，即種群的遺傳結(jié)構(gòu)[2]。一個(gè)物種的遺傳多樣性高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。豐富的遺傳多樣性意味著較高的適應(yīng)生存潛力，蘊(yùn)藏著較大的進(jìn)化潛能以及育種和遺傳改良潛力；而貧乏的遺傳多樣性則會(huì)給物種生存進(jìn)化以及種質(zhì)資源的保護(hù)和利用帶來許多不利影響。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(PARD)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)等標(biāo)記方法以及某些線粒體基因(CO I、16SrRNA、Cytb)等常用于生物種群遺傳多樣性分析，也被應(yīng)用于水產(chǎn)魚或蝦類野生或養(yǎng)殖群體的分析上[3～6]，但關(guān)于寶石鱸遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。

微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STRs)或簡單重復(fù)序列(SSR)，因其在基因組中分布廣泛，具較高的多態(tài)性、呈共顯性遺傳，且由于其分析方法相對簡便快捷也被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物種群遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)等領(lǐng)域[7]。微衛(wèi)星標(biāo)記分析通常是通過PCR擴(kuò)增、電泳檢測和片段大小分離分析各等位基因。傳統(tǒng)的片段分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，其分辨率和效率均較低。近年發(fā)展起來的SSR分型新方法, 通過熒光標(biāo)記的PCR引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)區(qū)域序列, 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)合分子量內(nèi)標(biāo)計(jì)算DNA片段長度，使SSR分型更高效與準(zhǔn)確[8]。

線粒體DNA(mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率快、母系遺傳等特點(diǎn)，其中一些基因D-loop、COI、Cytb等已被作為魚類遺傳多樣性和保護(hù)生物學(xué)研究的重要標(biāo)記[9～13]。DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)常被用于水產(chǎn)動(dòng)物分子鑒定研究[14]。線粒體控制區(qū) D-loop區(qū)為非編碼區(qū)，缺乏編碼的選擇壓力，比其它線粒體基因進(jìn)化速率更快，在群體遺傳變異及系統(tǒng)進(jìn)化等研究有較多應(yīng)用[15]。

本研究采用線粒體D-loop序列和SSR分析方法，對廣東4個(gè)寶石鱸養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并比較二者的分析結(jié)果，旨在更準(zhǔn)確地了解廣東地區(qū)寶石鱸養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性及種質(zhì)資源狀況，為其選育種工作提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品分別采自廣東省廣州市(番禺區(qū))、中山市和佛山市3個(gè)不同地區(qū)，其中廣州番禺群體(PY)24尾，中山群體(ZS)24尾，佛山群體1(FS1)24尾，佛山群體2(FS2)24尾，共計(jì)96尾。廣東廣州(番禺區(qū))、中山和佛山寶石鱸養(yǎng)殖群體分別由廣州市番禺區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、中山一力農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司和佛山市南海區(qū)西樵顯恒水產(chǎn)農(nóng)業(yè)有限公司惠贈(zèng)。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

剪取寶石鱸新鮮個(gè)體的鰭條，無水乙醇-20 ℃保存。采用廣州美基生物科技有限公司的HiPureMollusc DNA Mini Kit軟體動(dòng)物總DNA提取試劑盒，根據(jù)其說明書提取寶石鱸鰭條組織的總DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，多功能酶標(biāo)儀(BioTek)檢測DNA的濃度和純度，樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 線粒體序列片段的選擇及D-loop序列片段的擴(kuò)增及測序

根據(jù)GenBank中登錄的寶石鱸線粒體基因組序列(KP317810.1)[16]，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增線粒體D-loop片段的引物(表1)，擴(kuò)增長度分別為598 bp；先在8個(gè)隨機(jī)樣本中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL：TaKaRa Premix rTaq 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；之后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸10 min后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送廣州艾基生物科技有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在D-loop序列中一共檢測出8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。

1.4 微衛(wèi)星引物的篩選、擴(kuò)增及基因分型

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的寶石鱸肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取40個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成SSR引物，對8個(gè)隨機(jī)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：TaKaRa Premix rTaq 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；之后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度根據(jù)引物復(fù)性溫度設(shè)定)，72 ℃延伸1 min；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸10 min后4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的特異性，并送廣州艾基生物科技有限公司進(jìn)行測序。采用Qsep100全自動(dòng)核酸蛋白分析系統(tǒng)檢測微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性，從中篩選出11個(gè)特異性和多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點(diǎn)，由艾基生物有限公司合成熒光引物，用于本研究4個(gè)群體的擴(kuò)增(表1)。

表1 用于寶石鱸微衛(wèi)星序列及D-loop擴(kuò)增的引物序列及其退火溫度

SSR PCR產(chǎn)物分型委托艾基生物有限公司完成。11對微衛(wèi)星引物分成3組分別合成3種不同熒光標(biāo)記(表1)的引物，熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星引物分別擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)區(qū)域序列，3種不同熒光PCR產(chǎn)物混合成一管樣品進(jìn)行檢測。采用3730XL測序分析儀(ABI)對樣品的熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)合分子內(nèi)標(biāo)進(jìn)行DNA片段長度計(jì)算，根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增條帶分子量的差異性, 判斷每個(gè)個(gè)體各基因座的基因型。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Cluatal X軟件比對D-loop序列測序結(jié)果，并輔以人工校對。利用MEGA 6軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基含量，利用鄰接法基于K2P模型構(gòu)建寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體的單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)化樹各分支的自舉置信度水平由自舉法(bootstrap value)估計(jì)，自引導(dǎo)次數(shù)為1 000。通過DnaSP軟件統(tǒng)計(jì)單倍型(h)，計(jì)算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性遺傳多樣性(Pi)等參數(shù)。

SSR分析中獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)上等位基因的條帶大小后，將所得結(jié)果進(jìn)行歸類。使用POPGENE Version 1.31 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各群體每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon 指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳距離和基因流(Nm)。根據(jù)Nei's遺傳距離以及非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)，利用 MEGA 6軟件分別構(gòu)建群體間和個(gè)體間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。CERVUS3.0軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。ARLEQUIN 3.5軟件計(jì)算遺傳分化指數(shù)(FST)并進(jìn)行群體分子方差分析(AMOVA)。群體遺傳結(jié)構(gòu)采用STRUCTURE2.3 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 寶石鱸mtDNA D-loop序列、群體遺傳多樣性與群體遺傳分化分析

對寶石鱸4個(gè)群體共96個(gè)樣本的mtDNA D-loop基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增與測序，通過比對和人工校對，選擇了598 bp的序列用于進(jìn)一步的分析。共獲得變異位點(diǎn)14個(gè)，含有3個(gè)簡約信息位點(diǎn)，1個(gè)堿基位點(diǎn)缺失，1個(gè)堿基位點(diǎn)插入。變異位點(diǎn)數(shù)占分析位點(diǎn)的2.34%。4種堿基在此段序列中的平均含量為A(30.4%)、T(31.8%)、C(20.1%)、G(17.7%)，其中A+T含量為62.2%，明顯高于C+G含量。

從96個(gè)樣本中共定義8個(gè)單倍型(Hap)，其中單倍型Hap1為ZS和FS1、FS2 3個(gè)群體的共享單倍型，Hap3為PY和FS1、FS2 3個(gè)群體的共享單倍型，其它6個(gè)單倍型(Hap2, Hap4-8)為各群體特有(表2)。其中FS1群體擁有的單倍型最多，為6個(gè)；PY群體次之，為3個(gè)；FS2群體較少，為2個(gè)；ZS群體擁有單倍型最少為1個(gè)。Hap1和Hap3為優(yōu)勢單倍型，分別占個(gè)體總數(shù)的60.4%、32.3%。

表2 寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體中D-loop序列單倍型的分布

使用Dna SP(version 5.0)軟件計(jì)算寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體的2個(gè)遺傳多樣性參數(shù)：單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)。4個(gè)群體的Hd為0.000 0～0.543 5，以FS1群體為最高、ZS群體最低；Pi為0.000 00～0.001 76，其中FS1群體的Pi值最高(0.001 76)，而ZS群體不存在Pi(0.000 00)(表3)。表明4個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均極低。

表3 寶石鱸4個(gè)群體線粒體D-loop序列的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 寶石鱸SSR遺傳多樣性分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)篩選到11對微衛(wèi)星引物對，在4個(gè)寶石鱸群體中有較好的多樣性(表4)，進(jìn)一步用這11對微衛(wèi)星引物對4個(gè)寶石鱸群體共96個(gè)個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增與分型。結(jié)果顯示，11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在96個(gè)樣本中的PIC為0.233～0.609，平均PIC為0.391(表5)。各位點(diǎn)的基因流Nm為2.678～98.617(>1)，平均Nm為7.483。

表4 寶石鱸11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)群體中的預(yù)擴(kuò)增情況

Tab.4 Characterization of 11 microsatellite loci for 4 populations ofS.barcoo

位點(diǎn)基因大小基因型尾數(shù)PYZSFS1FS1L0262A=202B=208C=247AC---3BB2123BC111355CC11101713L0818A=226B=229C=232AA2-11AB6879BB-12-BC16151414L1002A=185B=197AA10533AB14182119BB-1-2L1766A=226B=247AA3279AB1520510BB62125L2017A=106B=109AA1-51AB181886BB561117L2052A=226B=246AB101434BB14102120L2462A=197B=232C=245AA121078AC10131716BB1---CC11--L2923A=202B=208C=211D=214AC---1BC1382123CD11162-L4246A=234B=240C=243D=246E=279AE96-1BB-1--BE-112CE11-1DE-2--EE14132320

續(xù)表

表5 寶石鱸96個(gè)樣品中11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多樣性參數(shù)

PY、ZS、FS1和FS2 4個(gè)群體的平均He為0.491、0.516、0.396、0.424，平均PIC為0.405、0.420、0.320、0.347，顯示4個(gè)群體的遺傳多樣性均較低。ZS群體的遺傳多樣參數(shù)略高于其它三個(gè)群體，但4個(gè)群體之間的He和PIC不存在顯著性差異(表6)。

下表(表7)是4個(gè)寶石鱸群體根據(jù)線粒體D-loop序列和SSR位點(diǎn)的AMOVA分析結(jié)果，基于線粒體D-loop序列分析 4個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)FST=0.403 5，顯示群體間具有較高程度的遺傳分化，而SSR的分析結(jié)果顯示FST極低，僅為0.044 5，二者差異較大。而對于遺傳變異來源的分析二者的結(jié)果則相近?；诰€粒體D-loop序列分析，遺傳變異有40.34%來自于群體間，59.66%來自于群體內(nèi)；根據(jù)11個(gè)SSR位點(diǎn)的分析遺傳變異來源，39.28%來自于群體間，60.72%來自群體內(nèi)。

表6 4個(gè)寶石鱸群體11個(gè)位點(diǎn)的平均遺傳多樣性參數(shù)

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)相同字母表示不存在顯著性差異

表7 4個(gè)寶石鱸群體根據(jù)線粒體D-loop序列和SSR位點(diǎn)的AMOVA分析結(jié)果

4個(gè)群體兩兩間的Nei’s遺傳相似度和遺傳距離如表8所示，其中遺傳相似度為0.953 7～0.987 6，遺傳距離為0.012 5～0.047 4。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹，4個(gè)養(yǎng)殖群體分聚成了2類，PY群體和ZS群體聚為一支，F(xiàn)S1、FS2兩個(gè)群體聚為另一支(圖1)。根據(jù)96尾寶石鱸個(gè)體間的遺傳距離構(gòu)建的UPGMA進(jìn)化樹(圖2)顯示4個(gè)群體呈鑲嵌式排列，未出現(xiàn)明顯的群體分支。

表8 4個(gè)寶石鱸群體的遺傳相似度和遺傳距離

注：對角線以上為遺傳相似度，對角線以下為遺傳距離

圖1 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的4個(gè)寶石鱸群體的UPGMA聚類樹

圖2 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的96個(gè)寶石鱸個(gè)體的UPGMA聚類樹

運(yùn)用STRUCTURE軟件分析4個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示對數(shù)似然函數(shù)值L(K)隨亞群數(shù)K的增加而增加，當(dāng)K=2時(shí)L(K)值開始趨于穩(wěn)定，開始出現(xiàn)平臺(tái)期，說明這4個(gè)群體可分為2個(gè)亞群(圖3)。其中PY、ZS、FS1、FS2 4個(gè)群體中分別有62.5%、75%、8.3%和20.8%為亞群I，37.5%、25%、91.7%和69.2%為亞群Ⅱ(圖4)，也即PY與ZS群體大部分個(gè)體為亞群I，而FS1與FS2群體大多屬于亞群Ⅱ。

圖3 L(K)值隨K的變化

圖4 參試4個(gè)寶石鱸群體在K=2時(shí)的遺傳結(jié)構(gòu)圖

3 討論

3.1 基于線粒體D-loop序列的寶石鱸群體遺傳多樣性

本研究利用線粒體D-loop 序列片段(598 bp)，分析4個(gè)寶石鱸養(yǎng)殖群體共96個(gè)樣本，共檢測出14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，定義了8個(gè)單倍型，并計(jì)算了核苷酸多樣性指數(shù)Pi和線粒體DNA的單倍型多樣性指數(shù)Hd。這二個(gè)參數(shù)是衡量群體DNA多態(tài)程度的重要指標(biāo)[17]。從單倍型多樣度(Hd=0.000 0～0.543 5，平均0.535)和核苷酸多樣性(Pi=0.000 00～0.001 76，平均0.001 39)的數(shù)值來看，本研究所分析的寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體的多樣性均較低。王沈同等[18]利用線粒體控制區(qū)片段(894 bp)對草魚野生及選育群體進(jìn)行遺傳變異分析，6個(gè)群體共276個(gè)樣本檢測出27種單倍型，野生群體和選育群體的單倍型多樣度及核苷酸多樣性分別為Hd=0.585 5、Pi=0.001 42，而選育群體的分別為Hd=0.429、Pi=0.000 92，說明野生群體的遺傳多樣性遠(yuǎn)比選育群體更豐富。董新培等[19]利用906 bp的線粒體D-loop區(qū)片段對不同地理區(qū)域的104個(gè)烏鱧樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示在104條序列中出現(xiàn)37個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，共定義27種單倍型。烏鱧遺傳群體的多樣性參數(shù)分別為Hd=0.875、Pi=0.003 72，說明烏鱧群體的遺傳多樣性較為豐富。本研究中寶石鱸的4個(gè)養(yǎng)殖群體的多樣性均低于上述草魚與烏鱧研究中的野生群體，但高于王沈同等的研究中草魚選育群體的對應(yīng)參數(shù)(Hd=0.429、Pi=0.000 915)。

遺傳分化指數(shù)FST多用于分析不同群體間的遺傳差異，F(xiàn)ST為0～0.05，表明群體間分化比較小；若FST為0.05～0.15，則群體間存在中等程度分化水平；若FST>0.15，群體間存在較高的分化水平[17]。本研究根據(jù)線粒體D-loop序列分析的4個(gè)寶石鱸養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)為FST=0.403 5，處于較高的分化水平。王沈同等[18]的研究(FST=0.403 12)中的草魚群體以及董新培等[19]的研究(FST=0.319 14)中烏鱧群體的結(jié)果相差不大，三者的分化水平相當(dāng)。

通過mtDNA D-loop序列對寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體的分析，顯示4個(gè)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性均較低，遺傳分化指數(shù)FST=0.403 5顯示群體間遺傳分化處于較高水平。4個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳分化主要來自群體內(nèi)部(59.66%)。

3.2 基于微衛(wèi)星位點(diǎn)的寶石鱸群體遺傳多樣性

在利用SSR進(jìn)行種群遺傳多樣性的評估中，常用群體PIC和雜合度(H)兩個(gè)指標(biāo)。PIC能反映出某個(gè)群體的遺傳變異程度和位點(diǎn)多樣性[20]，PIC>0.5的位點(diǎn)為高多態(tài)性位點(diǎn)，0.250.25，均具有中等以上的多態(tài)性。雜合度(H)用于描述群體遺傳學(xué)上的群體多態(tài)性，雜合度越高物種遺傳多樣性越豐富，對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[22]，當(dāng)期望雜合度處在0.5～0.8之間即可認(rèn)為該群體具有較高的多樣性。本實(shí)驗(yàn)中檢測的4個(gè)寶石鱸養(yǎng)殖群體平均期望雜合度處于0.396～0.516，僅有中山群體的平均期望雜合度略大于0.5，說明總體上這些養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均偏低。根據(jù)SSR分型結(jié)果計(jì)算群體間的遺傳分化分析結(jié)果顯示FST= 0.044 5，說明群體間的遺傳分化水平較低(FST<0.05)，也證明了4個(gè)群體之間的遺傳相似度較高，與Nei’s遺傳相似度和遺傳距離分析結(jié)果一致。

Nm是指一些個(gè)體從一個(gè)群體遷移至另一個(gè)群體過程中將某些基因帶入新群體，它對新群體的變異產(chǎn)生影響。不同群體間的基因流越大，遺傳相似性越高。當(dāng)Nm>1 時(shí)，可認(rèn)為群體之間的基因流較大，遺傳相似性較高[23]。本研究中的4個(gè)群體各位點(diǎn)的基因流均較高(Nm>1)，因此說明4個(gè)群體遺傳相似性高。個(gè)體間遺傳進(jìn)化樹(圖2)則反映出這些個(gè)體未因群體差異或來源而呈現(xiàn)出明顯的分群，從另一角度說明這4個(gè)群體間遺傳相似度較高。STRUCTURE 軟件是根據(jù)Pritchard等的方法開發(fā)而成[24]，它根據(jù)多位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)來劃分群體的結(jié)構(gòu)組成，將每個(gè)個(gè)體分配到不同亞群中，可分析群體間的混合區(qū)以及群體間的遷移等。K值反映了群體的亞群數(shù)，在ΔK最大時(shí)，其對應(yīng)的K值為適宜的亞群數(shù)[25]。本研究中通過STRUCTURE軟件分析，各群體中的個(gè)體均被分成2個(gè)亞群，但其中番禺群體和中山群體中有更多個(gè)體屬于亞群Ⅰ，佛山的2個(gè)群體則更多個(gè)體屬于亞群Ⅱ，提示中山群體與番禺群體、佛山群體1與群體2的遺傳關(guān)系較近，這與群體間遺傳進(jìn)化樹(圖1)分析結(jié)果一致。

基于11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析，4個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平偏低，其中中山群體的遺傳多樣性水平較高，遺傳分化指數(shù)FST=0.044 5顯示群體間遺傳分化處于較低水平。遺傳變異來源與D-loop的分析結(jié)果相似，主要為群體內(nèi)部(60.72%)。

3.3 綜合兩種分析方法分析4個(gè)群體的遺傳多樣性

本研究通過線粒體D-loop序列和SSR分析，均顯示4個(gè)寶石鱸養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平較低。根據(jù)SSR分析結(jié)果，中山群體在4個(gè)群體中多樣性相對較高，其期望雜合度(He=0.516)屬于中等水平。但根據(jù)D-loop序列分析結(jié)果來看中山群體的線粒體D-loop序列不存在多態(tài)性位點(diǎn)，全部個(gè)體屬于同一單倍型。這可能與線粒體DNA的遺傳特殊性有關(guān)。線粒體為母系遺傳，遺傳過程不經(jīng)過基因重組[9]，因此對于親緣關(guān)系較近的分析樣本而言，用其分析種群遺傳多樣性具有局限性。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)寶石鱸線粒體Cytb、COI和12S rRNA上的多態(tài)性位點(diǎn)更少，不適合用于對現(xiàn)有寶石鱸養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評估。

兩種分析方法的結(jié)果均顯示4個(gè)群體的遺傳分化大部分來自于群體內(nèi)。但兩種方法所得的群體遺傳分化指數(shù)FST差異較大，根據(jù)線粒體D-loop序列獲得的FST較大，(FST=0.403 5 >0.15)，說明群體間的遺傳分化處于較高水平，而根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析結(jié)果(FST=0.044 5)，群體間遺傳分化偏低。兩者在群體遺傳分化指數(shù)上的不同可能是由于兩者遵循不同的遺傳模式而導(dǎo)致變異速率存在差異[26]。如果種群間的基因流是由雄性個(gè)體造成的，那么就只有用核基因標(biāo)記才能檢測，因此微衛(wèi)星標(biāo)記在研究種群遺傳分化時(shí)可以獲得更為完善的信息[27]。寶石鱸引進(jìn)時(shí)間較長、批次較少，而性成熟時(shí)間較長(雌魚3年性成熟，雄魚成熟時(shí)間則更長為5年)，這就導(dǎo)致在繁殖過程中一尾雄魚可能與多尾雌魚配對，導(dǎo)致雄性產(chǎn)生的基因流大于雌性，所以對于本研究而言，使用SSR分析群體的遺傳分化應(yīng)更為準(zhǔn)確。

本研究使用SSR和線粒體D-loop序列分析寶石鱸4個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示4個(gè)群體的遺傳多樣性較低、群體間遺傳分化水平較低、遺傳距離很小，親緣關(guān)系較近，說明這4個(gè)養(yǎng)殖群體進(jìn)一步選育的潛力不足，因此有必要通過引進(jìn)原種以豐富國內(nèi)寶石鱸養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。本研究結(jié)果可為下一步寶石鱸種質(zhì)改良與品種選育提供依據(jù)。