基于ISSR技術(shù)的茭白種質(zhì)資源遺傳多樣性

王凌云，楊夢飛，李怡鵬，張尚法，鄭寨生

(金華市農(nóng)業(yè)科學研究院 蔬菜研究所，浙江 金華 321000)

茭白(ZizanialatifoliaTurcz.)，古稱菰，為禾本科菰屬多年生宿根性水生草本植物，原產(chǎn)于中國和東南亞[1]。古代采食其籽粒，作為糧食作物栽培。后因菰黑粉菌(UstilagoesculentaP.Henn.)侵染，在適宜條件下，茭白植株莖尖數(shù)節(jié)畸形膨大形成肥嫩的肉質(zhì)莖，為人們所食用[2-4]。茭肉白嫩細膩、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，是我國僅次于蓮藕的第二大類水生蔬菜。除作為蔬菜食用之外，在中醫(yī)學上，茭白性味甘、涼、滑、無毒，有止渴、開胃、除目黃、利大小便、預防高血壓和動脈硬化等功效。

茭白因受黑粉菌侵染，不再開花結(jié)實而轉(zhuǎn)化為無性繁殖，因此在茭白的栽培和選育種過程中，都是采用分株、分蘗等無性繁殖的方法。經(jīng)過長期的選育種和地區(qū)間相互引種，目前，我國茭白品種資源豐富且類型各異。通常根據(jù)茭白品種的外觀形態(tài)和農(nóng)藝性狀定向篩選茭白新品種，茭農(nóng)也常常根據(jù)自身需求對茭白品種進行篩選。此外，茭農(nóng)在茭白種植過程中普遍就近引種和自行命名，導致茭白品種上同種異名和同名異種問題嚴重，茭白品種間的親緣關(guān)系比較復雜和混亂。上述問題對茭白產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展產(chǎn)生了很大障礙，而形態(tài)鑒別很難確定品種或品系間的相互關(guān)系，因此在分子水平上明確茭白品種間的遺傳差異就顯得尤為重要。

目前分子標記已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定等方面。ISSR(inter-simple sequence repeats)分子標記是一種利用重復序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA進行擴增的標記體系[5]，即用微衛(wèi)星錨定引物退火至SSR區(qū)域，擴增出SSRs毗連區(qū)域，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離獲得指紋圖譜，從而揭示樣本間的遺傳多樣性。ISSR分子標記為隨機引物，無需預先了解DNA序列，具有能夠顯示較高多態(tài)性、重復性高、易于操作、對基因組DNA的質(zhì)量要求低等方面優(yōu)點[6-8]。

本研究針對茭白種質(zhì)資源和品種選育中存在的問題，應(yīng)用ISSR技術(shù)對茭白品種的DNA多態(tài)性進行分析，以期從分子水平上探討茭白品種間遺傳背景的差異，為茭白種質(zhì)資源與遺傳育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為金華市農(nóng)業(yè)科學研究院水生蔬菜資源圃保存的茭白品種和地方品系，共30份，具體為(1)金茭1號，(2)金茭2號，(3)嘉興茭，(4)象牙茭，(5)三口冷水茭，(6)一點紅，(7)美人茭，(8)天臺茭，(9)十月茭，(10)溫嶺茭，(11)老竹茭，(12)吳嶺茭，(13)湖州八月茭，(14)中秋茭，(15)浙茭2號，(16)龍茭2號，(17)浙茭3號，(18)嵊茭1號，(19)浙茭5號，(20)冬茭，(21)梭子茭，(22)黃巖雙季茭，(23)小蠟臺，(24)余杭茭，(25)浙茭911，(26)早茭，(27)白玉，(28)白種，(29)廣益茭，(30)曲靖單季茭。采集植物材料時，全部采集生長期的幼嫩葉片，試驗材料置超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測

每個材料稱取新鮮幼葉50 mg，在-30 ℃預冷的研缽中用液氮迅速研磨成粉狀，裝入2 mL離心管中；在離心管中加入預熱至65 ℃的2×CTAB提取緩沖液800 μL，加60 μL巰基乙醇混勻，65 ℃溫浴30 min，其間混勻2～3次；取出樣品待冷卻至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液，放置20～30 min后，12 000 r·min-1離心15 min；將沉淀晾干后溶于200 μL TE，加入400 μL 95%乙醇、20 μL 3 mol·L-1NaAC，-20 ℃沉淀1 h，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，500 μL 75%乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心10 min，加入30～50 μL TE溶解DNA，用質(zhì)量分數(shù)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量[9-11]。

1.2.2 ISSR引物

ISSR引物參照哥倫比亞大學UBC公布的96個ISSR引物序列，用提取的茭白DNA進行初步篩選。

1.2.3 PCR擴增

25 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，引物0.5 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，無菌水19 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(每一條引物都有相應(yīng)的最佳退火溫度)45 s，72 ℃ 2 min，45個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

按照電泳圖譜同一位置上ISSR條帶的有無進行統(tǒng)計，有條帶的記為1，無條帶的記為0，獲得原始0、1數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對試驗材料進行聚類分析，建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性

隨機挑取3個品種茭白的基因組DNA對合成的ISSR引物進行篩選，從中篩選出8個擴增帶型清晰、多態(tài)性適中的引物，用這8個引物對30份茭白材料進行多態(tài)性分析。擴增指紋圖譜如圖1～圖4所示。從圖片所顯示的擴增條帶上看，這些材料之間的差異并不大。每個引物可擴增出7～13條DNA譜帶，平均每個引物擴增9.63條DNA譜帶，8個引物共產(chǎn)生77條譜帶，其中31條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為40.26%。引物U840多態(tài)性條帶為5條，其余都只有2～4條；平均每個引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶的數(shù)目為3.5條，多態(tài)性百分率介于18.18%～41.66%。

圖1 引物U809和U810擴增結(jié)果

圖2 引物U811和U827擴增結(jié)果

圖3 引物U836和U840擴增結(jié)果

圖4 引物U886和U889擴增結(jié)果

2.2 遺傳相似系數(shù)和聚類

以30個茭白品種和77個位點的譜帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，用NTSYS2pc Version 2.10計算，獲得了兩兩不同的品種間遺傳相似性系數(shù)。結(jié)果表明，30個茭白品種的遺傳相似系數(shù)GS為0.88～0.94。其中，遺傳相似系數(shù)最大的是浙茭5號和浙茭2號，達到0.94，說明它們之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異小；曲靖單季茭和老竹茭與其他品種遺傳差異較大，遺傳相似系數(shù)分別為0.880和0.897。利用ISSR標記數(shù)據(jù)計算品種間的遺傳相似性系數(shù)矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建了30份茭白品種間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖5)，以0.916為閾值可以把剩下28個茭白品種分為3組。第一組分為2個次級亞類，分別是金茭1號、金茭2號等4個單季茭和余杭茭、浙茭911、早茭3個雙季茭，均是浙江本地品種和改良品種。第二組包括了浙江省近年來選育的大部分新品種，如龍茭2號、嵊茭1號、浙茭系列，同時包括了杭州地方資源和蘇州地方資源，如梭子茭、美人茭、象牙茭、八月白、小蠟臺等，它們具有較高的遺傳相似性。第三組同樣分為2個次級亞類，第一類天臺茭、溫嶺茭、黃巖雙季茭均來自浙江臺州，第二類白玉、白種、廣益茭全部來自江蘇蘇州，劃分較為清晰，它們也具有較高的遺傳相似性。

3 小結(jié)

品種間遺傳關(guān)系研究和遺傳多樣性分析對于作物育種具有十分重要的意義[12]。茭白常采用形態(tài)標記進行分類，但茭白是菰與黑粉菌共生的產(chǎn)物，形態(tài)特征受環(huán)境影響較大，鑒定比較困難。DNA指紋圖譜是遺傳物質(zhì)直接、直觀的體現(xiàn)，不受生物體組織部位、生長周期、環(huán)境因素的影響。ISSR標記因其多態(tài)性高、穩(wěn)定性強而得到肯定，在植物親緣關(guān)系與遺傳多樣性分析中應(yīng)用廣泛。本實驗在樣品采集時選用幼嫩茭白葉片，排除了黑粉菌的干擾，因此實驗結(jié)果能夠準確反應(yīng)茭白品種的遺傳基礎(chǔ)。

圖5 30個茭白品種的UPGMA聚類結(jié)果

茭白DNA的擴增圖譜差異不明顯，多態(tài)性分析得出30份茭白品種資源的多態(tài)性條帶百分率只有40.26%，可能在引物的篩選上還需改進。另一方面，供試材料的遺傳基礎(chǔ)狹窄，親緣關(guān)系比較接近，這與其他研究報道結(jié)果相似[13-14]，可能與供試材料主要來源于浙江、江蘇有關(guān)，兩地都是茭白的主要產(chǎn)區(qū)，地域位置近，長期以來品種資源交流密切，目前大面積推廣的品種都是基于兩地地方品種改良而來。遺傳相似度較高的茭白品種在栽培中表現(xiàn)出不同的外觀特征和農(nóng)藝性狀可能是黑粉菌侵染過程中不同亞種作用引起的。