乙型肝炎病毒S區(qū)基因突變對乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者預(yù)后的影響研究

吳忱思，趙樂，吳建華，王英南，張風賓，高立明，趙林，張衛(wèi)國，張瑞星*

原發(fā)性肝細胞癌（HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一。HCC是目前全球發(fā)病率第5位、死亡率第2位的惡性腫瘤，每年約有70萬人死于肝癌［1］，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是導(dǎo)致肝癌發(fā)病的主要危險因素之一［2］。HCC患者的臨床特征，包括腫瘤分期、腫瘤大小、病理類型、炎癥程度和門脈瘤栓，是影響其預(yù)后的重要因素。HCC復(fù)發(fā)率高、治療手段有限，因此患者的預(yù)后仍然較差［3-4］。

我國HCC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，這主要與HBV感染流行有關(guān)，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌［5-6］。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，根據(jù)第三次乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計，我國HBV的平均感染率為7.18%，其中慢性乙型肝炎患者高達3 000萬人［7］。根據(jù)HBV全基因序列或S區(qū)基因序列差異，HBV可分為A～J 10個基因型，我國HBV基因型主要為B型和C型［8-9］。

HBV是已知真核細胞中最小的病毒，由不完全的環(huán)狀雙鏈組成，其中一條較長的為負鏈，由3 200個堿基組成，包含4個開放讀碼框架（ORF），即S、X、C、P基因區(qū)，分別編碼外膜蛋白、X蛋白、核殼蛋白和聚合酶蛋白［10］。S基因區(qū)可分為3段，從上游開始依次為前S1（pre-S1）區(qū)、前S2（pre-S2）區(qū)和S區(qū)，HBV S區(qū)基因編碼的226個氨基酸組成的蛋白質(zhì)是乙肝表面抗原（HBsAg）的主要組成部分；pre-S2區(qū)和S區(qū)基因共同編碼中蛋白；pre-S1區(qū)、pre-S2區(qū)和S區(qū)3部分基因共同編碼大蛋白［11］。由于HBV缺乏DNA酶的校正功能，所以HBV特別容易引發(fā)基因突變［12］。近年來，多項研究表明HBV基因突變與肝癌患者發(fā)病密切相關(guān)［13-16］，HBV S區(qū)基因突變與HCC發(fā)病機制的關(guān)系已經(jīng)成為研究熱點，本研究旨在探討HBV S區(qū)基因突變與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織標本采集 本研究于2007—2009年采集在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行外科手術(shù)治療的46例乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌（HBV-HCC）患者的肝癌組織標本，患者均被證實感染HBV，并排除其他肝臟疾病。通過患者的臨床癥狀、體征、肝臟CT和/或MRI、血清甲胎蛋白（AFP）等檢查，診斷為HCC并行HCC根治術(shù)，在術(shù)前及術(shù)后均未接受美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南所推薦的放化療、靶向治療及局部介入治療。46例患者中女6例、男40例，中位年齡52歲。

本研究價值：

原發(fā)性肝細胞癌（HCC）的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病，乙型肝炎病毒（HBV）是導(dǎo)致其發(fā)病的重要相關(guān)因素。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，有研究表明HBV基因突變與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌（HBVHCC）患者發(fā)病密切相關(guān)，但是關(guān)于基因突變與肝癌患者預(yù)后的研究相對較少，因此研究基因突變對HBV-HCC患者預(yù)后的影響，對于提高患者生存期具有極其重要的意義，本研究發(fā)現(xiàn)門脈瘤栓和HBV S區(qū)529位點與HBV-HCC患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)，這一結(jié)果有利于在臨床中識別不良預(yù)后的HBV-HCC患者，及早治療，從而延長其生存期。

1.2 一般資料收集 年齡、性別、CHILD分級、基因型、腫瘤數(shù)目、門脈瘤栓、TNM分期、腫瘤大小。

1.3 術(shù)后隨訪 通過電話對患者或其家屬進行隨訪，隨訪時間截至2012年9月，生存時間從術(shù)后第1天開始計算，至死亡之日或隨訪結(jié)束日為止。以月為單位計算生存期，隨訪時間為3年，每3個月進行1次隨訪。本研究經(jīng)過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準。

1.4 基因組DNA提取、PCR擴增及基因測序 采集肝癌組織標本置于-80 ℃冰箱保存，應(yīng)用Promega公司DNA試劑盒，經(jīng)過細胞核裂解、RNA降解、蛋白沉淀、離心、純化等步驟提取基因組DNA，并置于-20 ℃冰箱保存。通過美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536）查找引物（見表1）。對HBV S區(qū)的DNA序列進行PCR擴增，采用美國Promega公司的PCR無色體系預(yù)混試劑盒，使用美國基因有限公司PCR儀（AS Applied Biosystems 9902）進行目的基因擴增。其產(chǎn)物應(yīng)用Life Technologies公司的ABI 7300 TaqMan平臺，通過多重PCR法測出HBV-HCC患者肝癌組織的HBV基因型，并進行循環(huán)測序及分析。為確保測序的準確性，對同一個樣本應(yīng)用雙向重復(fù)測序方法，以明確HBV S區(qū)基因的突變位點。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Log-rank檢驗分析生存率，采用Cox比例風險模型對HBV-HCC患者術(shù)后生存影響因素進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同一般資料HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率比較 46例HBV-HCC患者的基因分型為25例B型、21例C型。不同門脈瘤栓、TNM分期、腫瘤大小的HBVHCC患者3年生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 不同HBV S區(qū)基因突變位點HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率比較 本研究對HBV S區(qū)的DNA序列進行基因測序，共發(fā)現(xiàn)13個位點的突變頻率＞5%，其中529位點、735位點不同堿基HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 HBV-HCC患者術(shù)后生存影響因素分析 將臨床指標（年齡、性別、CHILD分級、腫瘤數(shù)目、門脈瘤栓、TNM分期、腫瘤大?。┖突蛲蛔兾稽c納入Cox比例風險模型進行分析，結(jié)果顯示門脈瘤栓、529位點是HBV-HCC患者術(shù)后生存的獨立影響因素（P＜0.05，見表4）。

3 討論

HBV屬嗜肝DNA病毒科，由于缺乏HBV聚合酶的校對功能，因此特別容易發(fā)生基因突變，HBV比其他DNA病毒的突變率高10倍以上［6，11］。由于HBV感染可以引起肝臟的病理及免疫損傷，基因突變的積累會直接影響病毒的活性和免疫應(yīng)答的強度，因此HBV基因突變所導(dǎo)致的病毒生物學(xué)變化在肝臟損傷過程中發(fā)揮著重要的作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，HBV突變主要集中在基因組的某些特定區(qū)域，例如基本核心啟動子（BCP）、pre Core/Core區(qū)和pre S/S區(qū)［18］。本研究重點探討HBV S區(qū)基因的突變與HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率的關(guān)系，并通過生存分析鑒定出與HBV-HCC患者預(yù)后相關(guān)的突變位點為529位點。

表1 HBV S區(qū)基因擴增和測序引物Table 1 Primer pairs used for amplification and sequencing of the S gene region of HBV

表2 不同一般資料HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率比較Table 2 Postoperative 3-year survival rate in HBV-associated HCC patients with different data

HBV S區(qū)是HBV復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域，其所編碼的蛋白是HBsAg的主要組成部分，由S區(qū)基因編碼的HBsAg是HBV主要的抗原域，由226個氨基酸組成，含有一系列的構(gòu)象性抗原表位，其主要的親水區(qū)位于aa99-169，其中最重要的免疫功能區(qū)域是位于aa124-147的“a”決定簇［11，19］，是HBsAg的主要作用位點。HBsAg可以刺激機體產(chǎn)生抗體從而清除HBV，有研究表明“a”決定簇區(qū)域的突變可能誘導(dǎo)HBsAg的抗原性或病毒的適應(yīng)性發(fā)生改變，甚至產(chǎn)生免疫逃逸，該區(qū)域的無義突變可以誘導(dǎo)HBsAg抗原性的改變，從而影響特異性抗體的產(chǎn)生［20-21］。如果突變位點位于“a”決定簇區(qū)域，該突變不會導(dǎo)致S區(qū)基因編碼的氨基酸替代，但是pre S/S區(qū)基因位點的突變，可能引起HBV聚合酶中的rtD134N的替代，從而導(dǎo)致HBV聚合酶的功能改變，進而影響病毒復(fù)制［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV S區(qū)529、735位點與HBV-HCC患者生存相關(guān)，目前尚未見國內(nèi)外文獻對于這兩個位點的報道。既往研究表明，HBV S區(qū)基因突變可以誘導(dǎo)幾個特定的膜蛋白產(chǎn)生，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳導(dǎo)通路，由此所產(chǎn)生的細胞毒性作用可以促進肝臟損傷并誘發(fā)疾病，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及大量活性氧的產(chǎn)生，可以引起DNA氧化損傷和基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生［6，23-25］。國內(nèi)外對于HBV S基因與HCC預(yù)后機制的研究尚未見報道，HBV S基因可能通過以上氨基酸替代、氧化損傷等過程，參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡，導(dǎo)致肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，從而影響了患者的生存期及預(yù)后。由于研究的局限性及發(fā)病機制的復(fù)雜性，對于HBV S基因突變與HCC致病及預(yù)后關(guān)系的研究有待進一步探討，本研究為單中心研究，如果擴大樣本量，將其推廣到多中心進行聯(lián)合研究，并進行長期觀察，將有利于從基因水平深入探討肝癌的發(fā)病機制，從而改善患者的預(yù)后。

表3 不同HBV S區(qū)基因突變位點HBV-HCC患者術(shù)后3年生存率比較Table 3 Postoperative 3-year survival rate in HBV-associated HCC patients by mutations in the S gene region of HBV

表4 HBV-HCC患者術(shù)后生存影響因素的Cox比例風險模型分析Table 4 Analysis of influencing factors for postoperative survival in HBV-associated HCC patients with the Cox proportional hazards model

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了與HBV-HCC患者術(shù)后預(yù)后相關(guān)的HBV S基因突變位點，在臨床上針對HCC患者進行相關(guān)HBV突變位點的基因檢測，有助于鑒定具有不良預(yù)后的HBV-HCC患者并對其進行個體化治療。該突變位點的發(fā)現(xiàn)對于提高HCC患者生存期、改善其預(yù)后具有重要意義。