PCDH17基因甲基化檢測對(duì)胃癌早期診斷的價(jià)值研究

朱春霞 周善學(xué) 胡桂梅 葉國良

胃癌在亞洲尤其是中國非常普遍，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。盡管胃癌診療技術(shù)的提高顯著延長了早期胃癌患者的生存率，但大多數(shù)胃癌患者診斷時(shí)已是中晚期，導(dǎo)致胃癌總體生存率不理想[2]。組織病理是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其屬有創(chuàng)檢查而受到一定的

限制，不適用于大規(guī)模篩查。因此，迫切需要尋找有效分子標(biāo)志物應(yīng)用于胃癌早期無創(chuàng)篩查及輔助診斷。胃癌發(fā)生過程涉及眾多遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的累積，導(dǎo)致癌基因功能獲得和抑癌基因功能缺失。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)特別是DNA甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3-5]。DNA甲基化在不改變DNA序列的情況下產(chǎn)生穩(wěn)定的可遺傳的基因表達(dá)改變，從而使體內(nèi)抑癌基因功能缺失[6]。DNA甲基化狀態(tài)改變發(fā)生于胃癌早期，可在外周血中檢測其水平變化，用于早期無創(chuàng)篩查胃癌病變有一定優(yōu)勢。原鈣黏附蛋白 17（protocadherin 17，PCDH17）位于 13q21.2，為鈣黏附蛋白超家族成員之一[7]。PCDH17在正常生理過程中發(fā)揮抑癌作用，但在多種腫瘤細(xì)胞中均因高甲基化致抑癌功能缺失[8-9]，而PCDH17基因甲基化與胃癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究將探討胃癌中PCDH17基因甲基化水平，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，評(píng)估其對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2011年5月至2017年6月在本院普外科及消化內(nèi)科住院治療的胃癌患者120例（普外科78例，消化內(nèi)科42例），男84例，女36例；年齡44～89歲，中位年齡67歲；病理分化：高分化18例，中低分化102例；腫瘤大?。?cm 57例，≤5cm 63例；病理分型：腺癌101例，印戒細(xì)胞癌19例；癌胚抗原表達(dá)陽性17例，陰性103例；糖類抗原19-9表達(dá)陽性19例，陰性101例；脈管侵犯陽性68例，陰性52例；淋巴管侵犯陽性54例，陰性66例；神經(jīng)侵犯陽性55例，陰性65例；腫瘤浸潤深度：T1～2期 21 例，T3～4期 99 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，無轉(zhuǎn)移57例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移7例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移113例；采用國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第8版）進(jìn)行臨床Stage分期，其中Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期64例。所有患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為初次就診，術(shù)前均未接受放化療；（2）既往均無腫瘤病史；（3）均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行組織病理檢查確診為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合患者住院期間臨床資料，同時(shí)存在其他腫瘤（其他部位原位癌或非胃癌轉(zhuǎn)移癌）的患者。選取同期本院健康體檢者120例作為對(duì)照。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1，胃癌細(xì)胞株MGC-803、AGS和SGC-7901來自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。上述細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 樣本收集、DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾 將手術(shù)切除或內(nèi)鏡下剝離的腫瘤組織及切緣正常組織立即存入液氮中，并及時(shí)保存于-80℃冰箱。120例胃癌患者的血漿標(biāo)本來源于上述患者術(shù)前采集，120例正常血漿標(biāo)本取自健康人群對(duì)照。抽取靜脈血后立即離心，3 000g離心10min，分離并得到血漿，-80℃凍存。應(yīng)用QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司）提取胃癌、對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本及正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1、胃癌細(xì)胞株 MGC-803、AGS和 SGC-7901基因組 DNA。應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國Qiagen公司）提取胃癌患者及健康體檢者的血漿樣本基因組DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量。應(yīng)用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit（美國ZYMO研究公司）對(duì)提取的全基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。所有操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書。

1.4 PCDH17基因甲基化水平測定 采用熒光定量甲基化特異性PCR法（quantitative methylation specific PCR，qMSP）。將經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾過的樣本DNA作為模板，以β-actin作為內(nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)DNA的量，應(yīng)用SYBR Green熒光染料，檢測樣本中甲基化水平。實(shí)驗(yàn)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler480，美國Roche公司）。qMSP過程所需引物：PCDH17正義：5′-GTTTGCCTTGC-TCTGGATGGTGG-3′，反義：5′-GTCCAGACCCAGATCTTCAGCGA-3′；β-actin 正義：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′， 反 義 ：5′-GAGCTACG-AGCTGCCTGACG-3′。樣本PCDH17和β-actin均重復(fù)3次。qMSP反應(yīng)體系為20μl，包括模板DNA 2μl，SYBR Green Master Mix 熒光染料 10μl，無 DNA 酶水6μl及上下游引物各1μl。qMSP反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10min，95℃變性 20s，60℃退火 40s，72℃延伸 30s，循環(huán)50次。樣本PCDH17基因甲基化水平應(yīng)用甲基化指數(shù)（percent of methylated reference，PMR）表示，其計(jì)算公式是：PMR=2-[（Ct樣本-Ct內(nèi)參）]×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，正常胃黏膜上皮細(xì)胞和3株胃癌細(xì)胞PCDH17基因甲基化水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，胃癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁正常組織PCDH17基因甲基化水平比較采用兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)；不同臨床病理特征的胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平和胃癌患者與健康體檢者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平比較采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析PCDH17基因甲基化水平在胃癌診斷中的價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常胃黏膜上皮細(xì)胞和3株胃癌細(xì)胞PCDH17基因甲基化水平比較 正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 PCDH17基因甲基化水平為0.39±0.05，胃癌細(xì)胞MGC-803、AGS和SGC-7901 PCDH17基因甲基化水平分別為67.83±6.87、33.93±4.92 和 43.21±2.69，3 株胃癌細(xì)胞 PCDH17基因甲基化水平均明顯高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 胃癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁正常組織PCDH17基因甲基化水平比較 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平為28.91（4.96，54.59），明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的5.16（1.02，17.81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與糖類抗原19-9表達(dá)情況、淋巴管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Stage分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、病理分化、腫瘤大小、病理分型、癌胚抗原表達(dá)情況、脈管侵犯、腫瘤浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P＞0.05），見表 1。

2.4 胃癌患者與健康體檢者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平比較 胃癌患者血漿樣本中PCDH17基因甲基化水平為32.56（5.59，53.86），明顯高于健康體檢者的 4.06（2.21，12.84），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 PCDH17基因甲基化水平對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 在胃癌組織中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的 AUC為 0.73，靈敏度為 0.58，特異度為 0.80，見圖1a。在血漿樣本中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.77，靈敏度為0.63，特異度為0.83，見圖1b。

3 討論

胃癌作為世界第五大惡性腫瘤之一，死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人類的健康[10]。目前，胃癌患者總體5年生存率偏低，晚期胃癌患者預(yù)后較差。而早期發(fā)現(xiàn)診斷胃癌是提高胃癌生存率的關(guān)鍵因素[11-13]。因此，尋找到早期診斷篩查的有效分子標(biāo)志物對(duì)提高胃癌早期診斷率及生存率具有重要意義，并能獲得巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

原鈣黏附蛋白（protocadherin，PCDHs）是鈣黏附蛋白超家族的新的亞家族，分為成簇的原鈣黏蛋白和非成簇的原鈣黏蛋白兩類[14]，主要參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞間的相互作用[15-16]。DNA異常甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)修飾之一，異?；蚣谆谀[瘤發(fā)生早期即可檢測到，可作為早期診斷和監(jiān)測腫瘤的有效分子標(biāo)志物[17]，亦可作為有效的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)[18-19]。Ying等[20]報(bào)道PCDHs在許多腫瘤中均發(fā)生高甲基化，如鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肝癌等。此外，PCDH8和PCDH20也分別在乳腺癌和非小細(xì)胞癌中發(fā)生高甲基化[21-22]。這提示PCDHs基因家族可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中扮演抑癌基因的角色[23-24]。PCDH17是PCDHs家族的主要成員之一，主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，具有抑制腫瘤生長的功能[25-26]。PCDH17作為一個(gè)新型抑癌基因，在許多腫瘤中因發(fā)生高甲基化而致功能缺失。Haruki等[25]報(bào)道PCDH17在食管癌中高甲基化且與食管癌的分化程度密切相關(guān)。在腎細(xì)胞癌中，PCDH17的甲基化水平同樣與其病理評(píng)分、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān)[27]。在膀胱癌中同樣能夠檢測到高甲基化PCDH17，并與患者不良預(yù)后相關(guān)[9]。PCDH17基因甲基化水平不僅可作為多種腫瘤預(yù)后評(píng)判指標(biāo)，也可作為腫瘤篩查診斷指標(biāo)[7]。而本研究將探討PCDH17基因與胃癌的關(guān)系，評(píng)估其甲基化水平對(duì)胃癌的診斷效能。

表1 胃癌組織中PCDH17基因甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的ROC曲線（a：胃癌組織；b：血漿樣本）

本研究中，筆者首先從細(xì)胞及組織樣本兩個(gè)層面明確胃癌中PCDH17基因甲基化水平明顯升高。通過結(jié)合患者臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，PCDH17基因甲基化水平在淋巴管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Stage分期Ⅲ～Ⅳ期患者中均明顯升高，表明PCDH17基因甲基化可能在胃癌疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。癌組織基因的相關(guān)變化可在體液或分泌物（痰液、大便、血液等）中檢測到，并且在這些體液中的變化可以一定程度上反映組織中同一基因的變化情況[28-29]。因此，為評(píng)價(jià)PCDH17基因甲基化的早期無創(chuàng)篩查價(jià)值，筆者分別比較PCDH17基因甲基化在胃癌組織和血漿樣本中的診斷價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.73，靈敏度為0.58，特異度為0.80；在血漿樣本中，PCDH17基因甲基化水平用于診斷胃癌的AUC為0.77，靈敏度為0.63，特異度為0.83。結(jié)合上述結(jié)果，筆者認(rèn)為PCDH17基因甲基化水平檢測具有無創(chuàng)、簡便、靈敏性較高的優(yōu)勢，是輔助診斷胃癌較為理想的生物標(biāo)志物。本研究尚存在一些局限性，尚未在胃癌癌前病變?nèi)巳貉獫{樣本中檢測PCDH17基因甲基化水平，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大PCDH17基因甲基化檢測的臨床應(yīng)用范圍。

綜上所述，本研究證實(shí)了胃癌中PCDH17基因甲基化水平明顯增高，且在淋巴管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Stage分期Ⅲ～Ⅳ期患者中明顯升高。PCDH17基因甲基化水平可作為胃癌的早期無創(chuàng)篩查的生物標(biāo)志物。