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    富氫鹽水對(duì)大鼠腸缺血再灌注凝血功能的影響

    2019-05-18 07:51:06馨,杜娟,楊博,周
    關(guān)鍵詞:富氫造模鹽水

    范 馨,杜 娟,楊 博,周 軍

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,四川瀘州 646000)

    機(jī)體凝血功能受到促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié),生理狀態(tài)下三大系統(tǒng)協(xié)調(diào)工作,維持凝血功能穩(wěn)定,不會(huì)形成血栓或者出現(xiàn)出血傾向。當(dāng)機(jī)體面臨炎癥打擊、缺血缺氧、酸中毒、細(xì)菌病毒感染等情況時(shí),凝血功能出現(xiàn)異常,誘發(fā)出血或血栓形成,可能出現(xiàn)DIC、MODS等嚴(yán)重后果[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),腸缺血再灌注會(huì)損傷腸、肝、腎、腦、肺等器官乃至出現(xiàn)全身多器官功能衰竭[4],還會(huì)激活凝血系統(tǒng)[5],而對(duì)于腸缺血再灌注后凝血功能的具體變化鮮有研究。近年來(lái),關(guān)于氫氣和富氫鹽水的研究涉及到各種疾病,它對(duì)缺血再灌注、膿毒血癥、糖尿病、肝性腦病、癡呆、急性肺損傷等均有治療作用,能顯著減弱腸缺血再灌注對(duì)器官組織的傷害,保護(hù)器官功能[6-10]。但關(guān)于富氫鹽水對(duì)大鼠腸缺血再灌注后凝血功能的影響少有報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腸缺血再灌注模型,予以富氫鹽水干預(yù),觀察大鼠凝血功能變化。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)成年雄性SD大鼠32只,體重220~250 g,許可證號(hào)為SYXK(川)2018-065,所有操作均經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查并同意。主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材:1∶9枸櫞酸鈉抗凝管,全自動(dòng)凝血儀Stago-evolution(北京斯塔高公司),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),富氫鹽水(青島泛潤(rùn)經(jīng)貿(mào)有限公司)等。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

    將32只SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只:生理鹽水對(duì)照組(C組),富氫鹽水對(duì)照組(H組),腸缺血再灌注組(R組),富氫鹽水處理組(R+H組)。

    1.3 造模取材

    造模參照本課題組既往研究[11],如在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇大鼠造模失敗或意外死亡,則補(bǔ)足大鼠后再行造模。大鼠造模前禁食12 h,自由飲水。稱重后經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。備皮消毒,在劍突下1 cm處,沿腹正中線開(kāi)腹,尋找腸系膜上動(dòng)脈(SMA)并充分暴露。C組和H組僅暴露SMA不夾閉,R組和R+H組用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉SMA。R組和R+H組在腸缺血持續(xù)90 min后,再次開(kāi)腹,松開(kāi)動(dòng)脈夾,恢復(fù)血供,造成缺血后再灌注。在再灌注開(kāi)始前10 min經(jīng)尾靜脈注射富氫鹽水(10 mL/kg),生理鹽水(10 mL/kg)通過(guò)同樣的方式給予。造模完成后取距回腸末端5 cm處小腸段1 cm,并經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3 mL。

    1.4 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化

    小腸段經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h后,包埋切片,行HE染色,在光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察小腸黏膜,并根據(jù)改良Chiu's評(píng)分評(píng)價(jià)損傷程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:正常絨毛和腺體為0分;部分絨毛頂部改變,上皮下Gmenhagen腔開(kāi)始形成為1分;上皮下Gmenhagen腔開(kāi)始形成,腺體輕度損傷為2分;上皮下間隙增大,毛細(xì)血管充血為3分;上皮與固有層中度分離,腺體損傷為4分;部分頂部絨毛脫落為5分;絨毛脫落明顯,毛細(xì)血管擴(kuò)張為6分;固有層絨毛脫落,腺體損傷明顯為7分;固有層開(kāi)始消化、分解為8分;出血、潰瘍?yōu)?分[12]。

    1.5 凝血功能檢測(cè)

    血液標(biāo)本用1∶9枸櫞酸鈉抗凝管收集,在室溫靜置30 min后離心(3 000 r,10 min),取上清液(血漿)于1.5 mL EP管中,2 h內(nèi)在全自動(dòng)凝血儀上機(jī)檢測(cè)以下凝血功能指標(biāo):凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(PT-INR)。

    1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 小腸黏膜病理學(xué)形態(tài)變化及Chiu's評(píng)分

    與C組相比,R組及R+H組小腸黏膜損傷程度明顯加重,Chiu's評(píng)分明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);R+H組與R組比較,小腸黏膜損傷程度減輕,Chiu's評(píng)分降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H組與C組相比,Chiu's評(píng)分沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。光鏡下觀察到的各組小腸黏膜如圖1所示。

    圖1 各組大鼠小腸黏膜病理變化(HE染色,×200)及Chiu's評(píng)分

    2.2 血漿PT、APTT、FIB、TT、PT-INR變化

    各組大鼠凝血功能如圖2所示,R組及R+H組PT、APTT、TT時(shí)間均較C組延長(zhǎng),F(xiàn)IB水平降低,PT-INR值升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與R組相比,R+H組PT、APTT、TT時(shí)間縮短,F(xiàn)IB水平升高,PT-INR值降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H組和C組相比,以上指標(biāo)無(wú)明顯差異(P > 0.05)。

    圖2 各組大鼠凝血功能相關(guān)指標(biāo)比較

    3 討 論

    正常機(jī)體中,促凝系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)的生理平衡,一旦這種平衡被打破,凝血功能便會(huì)出現(xiàn)異常,可能形成血栓,亦可出現(xiàn)出血;若凝血功能紊亂持續(xù)不能得到糾正,凝血因子耗竭,血小板大量減少,可能出現(xiàn)失血性休克,也可導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC),損害心、肺、肝、腎、腦等多個(gè)器官,出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(MODS),嚴(yán)重者死亡[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),病理狀態(tài)下凝血功能異常與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,不同炎癥狀態(tài)下,凝血功能異常程度不同[13]。因此,在各種臨床疾病診療過(guò)程中,維持凝血功能正常非常重要。

    在臨床工作中,醫(yī)生對(duì)凝血功能的關(guān)注首要有以下幾個(gè)基礎(chǔ)指標(biāo):凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(PT-INR)。PT和APTT代表凝血系統(tǒng)功能,分別反映外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能,二者時(shí)間延長(zhǎng)提示出血可能,縮短提示高凝狀態(tài);TT和FIB代表纖溶系統(tǒng)功能,變化方向通常相反,F(xiàn)IB水平升高時(shí)提示高凝,降低提示出血傾向;PT-INR值在臨床上主要用于監(jiān)測(cè)抗凝藥物使用后凝血功能的變化,當(dāng)其值高于4.0時(shí),提示血液凝固需要很長(zhǎng)時(shí)間,可能引起無(wú)法控制的出血。而INR值低于2.0時(shí)不能提供有效的抗凝,提示抗凝藥物也許需要調(diào)整[14]。INR大于正常值(0.8~1.2),可能出現(xiàn)出血征象,需警惕出血風(fēng)險(xiǎn)。

    腸缺血再灌注在臨床上常見(jiàn),多由于腹主動(dòng)脈瘤、小腸移植等手術(shù)因素或是腸系膜血栓栓塞、失血性或感染性休克、嚴(yán)重?zé)齻燃膊∫蛩卣T發(fā),炎癥反應(yīng)是其病理生理機(jī)制中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)[15]。在本實(shí)驗(yàn)中,腸缺血90 min后再灌注2 h,小腸黏膜絨毛脫落,腺體損傷明顯,固有層充血水腫,表明造模成功。大鼠腸缺血再灌注后,凝血功能的變化表現(xiàn)為PT、APTT、TT的時(shí)間延長(zhǎng),F(xiàn)IB水平降低,PT-INR值增大,有出血傾向。

    氫氣,自然界中存在的最小氣體分子,具有易得到、無(wú)毒性、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。自2007年報(bào)道氫氣具有抗氧化能力以來(lái),它被應(yīng)用于各種疾病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及少數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)中,故而發(fā)現(xiàn)其還具有抵抗炎癥、抑制凋亡、細(xì)胞保護(hù)等作用[9,16]。研究發(fā)現(xiàn),氫氣對(duì)全身各大系統(tǒng)均有保護(hù)作用,如吸入氫氣可以緩解癡呆病情發(fā)展、依賴Akt/GSK3β信號(hào)通路減弱心肌缺血再灌注損傷、改善代謝綜合征、治療肺動(dòng)脈高壓、治療肺吸蟲(chóng)誘導(dǎo)的慢性肝炎、抗癌等[10,17-20],富氫鹽水是氫氣溶解于生理鹽水中所得,和氫氣具有相同功能。有研究說(shuō)明富氫鹽水經(jīng)腹腔注射,對(duì)腦缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型具有神經(jīng)保護(hù)作用,效果和吸入氫氣相似[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,富氫鹽水干預(yù)大鼠腸缺血再灌注模型后,小腸黏膜損傷減輕,凝血功能指標(biāo)變化減小,凝血功能異常得到一定程度的糾正,減小了出血風(fēng)險(xiǎn)。而富氫鹽水對(duì)凝血功能正常的大鼠,不影響其凝血功能。

    4 結(jié)論

    在大鼠腸缺血再灌注后,小腸黏膜損傷嚴(yán)重,凝血功能發(fā)生改變,有出血傾向,富氫鹽水可以減輕小腸黏膜病理變化,并改善凝血功能異常狀態(tài),減小出血風(fēng)險(xiǎn)。但本研究仍存在不足之處,如小腸黏膜損傷程度與凝血功能異常程度相一致,那么兩者之間是否會(huì)存在相關(guān)性,以及富氫鹽水改善腸缺血再灌注后凝血功能異常的具體機(jī)制均有待進(jìn)一步探討。

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