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    告達(dá)庭衍生物抑制人乳腺癌細(xì)胞遷移和血管生成作用研究

    2019-05-18 07:44:00金湛甘椿椿陳高胡高波姚水洪
    人人健康 2019年23期
    關(guān)鍵詞:糖苷創(chuàng)口培養(yǎng)基

    金湛 甘椿椿 陳高 胡高波 姚水洪

    (衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江衢州 324000)

    乳腺癌是世界三大最常見癌癥之一,并且是女性發(fā)病率最高的腫瘤。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),2012年全球約有1700萬人被診斷患有乳腺癌,而每年約有50萬死于乳腺癌[1]。2018年全球乳腺癌新增病例占所有癌癥的11.6%,與肺癌并列第一,死亡人數(shù)多達(dá)62萬余人[2,3]。所以乳腺癌的診斷和治療顯得尤為重要。目前對(duì)乳腺癌的治療手段主要有手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療等,早期診斷出乳腺癌一般可以治愈,然而乳腺癌仍是導(dǎo)致死亡的重要罪魁禍?zhǔn)祝蚩赡苁怯捎谏罘绞礁淖兒腿狈ο冗M(jìn)的診斷和治療手段。因此尋找和開發(fā)新的、低毒高效的治療乳腺癌藥物已刻不容緩[4]。

    從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的藥物是新藥開發(fā)項(xiàng)目中的常見的策略,而且 有很多藥物都是基于這一方式發(fā)現(xiàn)的,如紫杉醇、喜樹堿、嗎啡等[5]。白首烏為蘿科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(CynanchumauriculatumRoyle ex Wight)的干燥塊根,是傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥。中國長期以來白首烏通常被用作功能性食品和滋補(bǔ)劑,常規(guī)治療功效如補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、黑須發(fā)及延年益壽等?,F(xiàn)代藥理研究表明,白首烏具有多種藥理作用,包括抗衰老、抗炎、抗腫瘤,抗氧化,免疫調(diào)節(jié),保肝和脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用等[6-8]。C21甾體苷類化合物通常被認(rèn)為是白首烏的主要活性成分,研究表明其具有顯著抗腫瘤活性[9],從白首烏中分離得到的C21甾體苷元告達(dá)庭(Caudatin)對(duì)人多種腫瘤都具有顯著抑制作用,如胃癌、肝癌、肺癌等[10-12]。然而在生物體中告達(dá)庭通常是以糖苷的形式存在,在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)告達(dá)庭衍生物,告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(3-O-β-D-cymaropyranoside)對(duì)乳腺癌生長具有良好抑制作用[13]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上繼續(xù)探討告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力具有抑制作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株:人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

    1.1.2 藥物:告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)自制,純度>98%,配制成10mg/ml的母液,溶劑為DMSO,于-20℃分裝保存。

    1.1.3 試劑:DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Invitrogen公司;MTT、DMSO購自美國Sigma公司;H&E染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司;anti-cyclin D1,anti-β-tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全DMEM/F12培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞呈貼壁生長,密度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

    1.2.2 MTT法測定細(xì)胞活力:收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化并離心后,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100μL。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁完全后,加入不同濃度的Ca-G,濃度梯度設(shè)置為2.5,5,10,15μg/mL,另外設(shè)置溶劑對(duì)照組(不加藥,加入DMSO)和空白調(diào)零組(只加培養(yǎng)液、不加細(xì)胞和藥物),均設(shè)4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL,孵育4h,吸凈孔內(nèi)液體,每孔加入150 μL的DMSO,震蕩10 min,使藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解,用酶標(biāo)儀于570nm處測各孔吸光度(OD)值,并計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率。相對(duì)細(xì)胞存活率(%)=(給藥孔-空白調(diào)零孔/對(duì)照孔-空白調(diào)零孔)×100%。

    1.2.3 創(chuàng)口愈合:收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化并離心后,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,接種于6孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度為6×105個(gè)/皿,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁90%以上后,用200 μl槍頭沿滅菌尺垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕。小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗3遍以洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài),并加入不同濃度梯度藥物(0,5,10 μg/mL)。分別于劃痕 0,12,24 h 在顯微鏡下拍照記錄創(chuàng)口愈合情況,運(yùn)用Image J軟件計(jì)算創(chuàng)口愈合間距和相對(duì)創(chuàng)口愈合率(即細(xì)胞相對(duì)遷移率)。

    1.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn):收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化并離心后,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105個(gè)/ml。在Transwell小室下室加入 500 μl含不同藥物濃度(0,5,10 μg/mL)的10%FBS的完全培養(yǎng)基。上室加入取100 μl細(xì)胞懸液。將細(xì)胞置于37℃,5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。18h后終止培養(yǎng),取出小室。用甲醇固定,蘇木素和尹紅各染5min,沖去殘余的染料。Transwell小室在正置顯微鏡下觀察,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)遷移率。

    1.2.5 westernblot:收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化并離心后,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁完全后,加入不同濃度藥物(0,5,10μg/mL),培養(yǎng)箱中孵育24 h后,收集各組細(xì)胞。加入適量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量測定試劑盒說明書檢測樣品蛋白含量,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗,過夜。并加入二抗,按照ECL顯影液試劑盒說明書,放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),曝光。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)的比較均采用t檢驗(yàn),★p<0.05,★★p< 0.01,★★★p< 0.001 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    圖1 創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)檢測Ca-G對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

    2.1 Ca-G對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力的影響 如圖1所示,MTT結(jié)果顯示不同濃度的Ca-G給藥24 h后,15μg/mL加藥組乳腺癌細(xì)胞株的活力明顯降低,而在15μg/mL以下濃度基本無細(xì)胞毒作用,故在接下來的實(shí)驗(yàn)中選用5,10 μg/mL的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

    2.2 Ca-G對(duì)細(xì)胞遷移的影響 在Ca-G非細(xì)胞毒劑量下本研究檢測了Ca-G對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的作用,創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,Ca-G能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞向中心遷移,結(jié)果說明藥物在一定程度能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移。而Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示,在加入Ca-G后,從上室穿到下室的細(xì)胞量明顯減少,說明細(xì)胞的遷移率明顯下降,以上結(jié)果均表明Ca-G能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移。

    圖2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測Ca-G對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

    2.3 Ca-G對(duì)血管生成關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),VEGF一般被認(rèn)為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGFR的活化可導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活,如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT),粘著斑激酶(FAK)。在本研究中,對(duì)Ca-G的抗血管生成作用及潛在機(jī)制進(jìn)行了研宄,結(jié)果顯示,Ca-G作用后,VEGF、AKT、FAK蛋白表達(dá)均有所下降。結(jié)果表明,Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號(hào)通路顯著抑制乳腺癌細(xì)胞血管生成,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 Ca-G對(duì)乳腺癌細(xì)胞血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

    3 討論

    中藥,由于其特殊的藥理活性、低毒性和不易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn),在癌癥治療中呈現(xiàn)出良好的研究與應(yīng)用前景。白首烏中C21甾體苷在體內(nèi)外研究中,均具有良好的抑制腫瘤作用,告達(dá)庭作為其中一種苷元也起到一定抗腫瘤作用,但是其在白首烏中的含量較低。告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)是以告達(dá)庭為苷元形成的一種糖苷類化合物。很少報(bào)道其是否具有抗腫瘤作用。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca-G能夠劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞內(nèi)cyclin D1的表達(dá),可能與阻滯細(xì)胞周期G0/G1期相關(guān)[13]。

    對(duì)于惡性腫瘤,除了表現(xiàn)無限繁殖特征,并且能夠進(jìn)行局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,隨著進(jìn)一步惡化,可滲入周圍的血管和淋巴管,腫瘤細(xì)胞會(huì)從這些血管和淋巴管中逃脫,從而進(jìn)入遠(yuǎn)端組織的薄壁組織,在這個(gè)過程中不斷地為腫瘤提供必需的營養(yǎng)物質(zhì),從而引發(fā)的新血管的形成,并幫助去除代謝廢物[14,15]。

    細(xì)胞劃痕是指在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上,劃痕致傷,通過制造體外貼壁細(xì)胞創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,來觀察腫瘤細(xì)胞遷移能力的強(qiáng)弱。本研究通過創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細(xì)胞的創(chuàng)口愈合能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物作用后MDA-MB-231細(xì)胞的創(chuàng)口愈合速度明顯下降,說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移。

    Transwell遷移實(shí)驗(yàn)指用聚碳酸酯膜將高營養(yǎng)培養(yǎng)基和低營養(yǎng)培養(yǎng)基隔開,再將腫瘤細(xì)胞放入低營養(yǎng)培養(yǎng)基中,為了得到營養(yǎng),腫瘤細(xì)胞必須穿過膜進(jìn)入高營養(yǎng)培養(yǎng)基中,而穿過膜進(jìn)入高營養(yǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)的多少就能反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。本研究通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物作用后MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力顯著減弱,說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移,本實(shí)驗(yàn)與創(chuàng)口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

    由腫瘤細(xì)胞增殖和遷移引發(fā)的新血管形成稱為血管生成,在腫瘤生長過程中這種血管不斷為腫瘤提供新的營養(yǎng)物質(zhì),去除代謝物。如果沒有新血管的形成,腫瘤生長會(huì)受到一定限制。因此,血管生成是腫瘤生長的其中一個(gè)關(guān)鍵步驟,抗血管生成己成為近年來研究腫瘤治療的關(guān)鍵方法[16,17]。血管生成可受到多種生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。在這些因子中產(chǎn)生最多的是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),VEGF一般被認(rèn)為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGF的通過結(jié)合受體酪氨酸激酶來刺激腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和管形成。VEGF受體(VEGFR)活化可導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活,如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT),粘著斑激酶(FAK)[18,19]。本文章研究了Ca-G的抗血管生成作用及潛在機(jī)制,結(jié)果表明,Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號(hào)通路顯著抑制乳腺癌細(xì)胞迂移。

    總之,告達(dá)庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷可有效抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的遷移和血管生成的活性。這為告達(dá)庭及其衍生物抗腫瘤轉(zhuǎn)移和新生血管生成的進(jìn)一步研究提供一定基礎(chǔ)。

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