鐵皮石斛分子遺傳學(xué)和多組學(xué)研究進展

喬宇琛 周思靜 宋梅芳 王平 劉桂君

（1. 北京市輻射中心，北京 100015；2. 北京師范大學(xué)射線束技術(shù)教育部重點實驗室，北京 100875）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo，D. officinale）是一種蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）的多年生草本植物，是一種古老、極具藥用價值的中藥材，藥用部分主要是新鮮的莖或干燥的莖，又稱“石斛楓斗（Dendrobii officinalisCaulis）”，性甘，微寒，有益胃生津、滋陰清熱的功效［1-2］，享有“九大仙草”之首的美譽［3］，且兼具較強的觀賞性。鐵皮石斛野生資源在自然條件下需要與某些真菌共生才可萌發(fā)、加上過度采挖和生境破壞而瀕臨滅絕。1988年，國務(wù)院發(fā)布的《野生藥材資源保護管理條例》，將鐵皮石斛列為三級保護品種［4］；1991年，在《中國植物紅皮書》中被收錄為稀有瀕危植物［5］；2018年5月正式進入藥食同源植物名錄。由于其藥用價值較高，市場需求量大，且現(xiàn)在人工栽培技術(shù)也較為成熟［6-7］，我國鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)近年來快速發(fā)展，年產(chǎn)值近100億元［8］。

鑒于鐵皮石斛重要的食藥用價值和巨大的應(yīng)用前景，已成為近年來人們研究的熱點。但大部分研究還是集中在成分提取、多糖的功能、產(chǎn)品開發(fā)及人工栽培技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化等方面［9-12］。然而，隨著不斷迭代的測序技術(shù)的出現(xiàn)［13］，以及新的分子生物學(xué)方法的開發(fā)［14］，對鐵皮石斛在分子生物學(xué)方面的研究也越來越多。本文綜述了近期國內(nèi)外有關(guān)鐵皮石斛在分子遺傳學(xué)、基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組與代謝組方面的研究，旨為今后更好的從分子生物學(xué)角度開發(fā)應(yīng)用鐵皮石斛這一重要資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 鐵皮石斛分子遺傳學(xué)

1.1 分子鑒定與遺傳多樣性分析

建立DNA指紋圖譜、篩選合適的分子標(biāo)記技術(shù)，有利于鑒定和篩選鐵皮石斛優(yōu)良品種、規(guī)范市場秩序與規(guī)避摻假。目前用于鐵皮石斛鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)有隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）及相關(guān)技術(shù)、序列相關(guān)擴增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）及相關(guān)技術(shù)、簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR）及相關(guān)技術(shù)、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）及相關(guān)技術(shù)、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon rargeted polymorphism，SCoT）和 基因芯片（Genechip）等。

同時，上述標(biāo)記技術(shù)還可用于鐵皮石斛的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析。鐵皮石斛作為珍稀瀕危的重要食藥兩用植物，確定其遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平可有利于鐵皮石斛種質(zhì)資源的保護和可持續(xù)利用。多項研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的鐵皮石斛在物種水平上具有豐富的遺傳多樣性，而居群間遺傳分化程度較低［15-17］。可能的原因是其多生長在懸崖峭壁上，自然繁殖能能力較低，居群間的基因交流少［18］。此外，自交不親和性也是保持鐵皮石斛在物種水平上具有較高遺傳多樣性的重要原因［19］。一個物種的遺傳多樣性水平還會受到地理分布的影響，一般而言，廣泛分布的物種的遺傳變異水平可能比狹窄分布的物種的遺傳變異水平要高［20］。在我國鐵皮石斛野生種質(zhì)資源較為廣泛地分布于安徽、福建、廣東、廣西、貴州、湖南、江西、四川、臺灣、云南和浙江等省。

1.1.1 RAPD標(biāo)記及相關(guān)技術(shù) RAPD標(biāo)記技術(shù)是較早，同時也是應(yīng)用最廣的一種分子鑒定手段。張銘等［21］對石斛屬內(nèi)26 個種的基因組DNA進行RAPD分析，可從其中方便快捷地鑒別出鐵皮石斛。丁鴿等［15］采用RAPD標(biāo)記技術(shù)，找到引物S412可以有效鑒別鐵皮石斛的8 個野生居群，且居群間具有較豐富的遺傳多樣性。王慧中等［22］采用RAPD標(biāo)記技術(shù)篩選出10 對隨機引物可以很好地區(qū)分13 種石斛屬植物，且發(fā)現(xiàn)供試石斛屬植物遺傳多樣性高。金波等［23］以擴增得到的鐵皮石斛特異RAPD序列為基礎(chǔ)，設(shè)計出一對新的特異性引物，擴增得到了300 bp序列特異性擴增區(qū)（Sequence characterized amplified regions，SCAR）標(biāo)記片段，能特異性的快速鑒定鐵皮石斛樣品。SCAR標(biāo)記是由RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化而來，所用引物較長，引物序列與模板DNA完全互補，具有良好的擴增嚴(yán)謹(jǐn)性，且擴增結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性強。

1.1.2 SRAP標(biāo)記及相關(guān)技術(shù) SRAP標(biāo)記技術(shù)是一種操作簡單、產(chǎn)量中等、成本低、可信度高和易于測序的分子鑒定方法。Ding等［16］采用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析了來自9 個野生居群的84 個鐵皮石斛個體，檢測到物種水平上較高的遺傳多樣性，但與具有相似生活史特征的其他物種相比，居群水平上的遺傳多樣性較低。包英華等［17］采用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析8個鐵皮石斛居群的DNA條帶多態(tài)性，最終篩選出7對有效的SRAP引物組合，經(jīng)過遺傳分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平較高，且居群內(nèi)的遺傳分化偏高于居群間。李懷志等［24］使用25對SRAP引物對供試的鐵皮石斛進行遺傳多樣性分析，共獲得86 條多態(tài)性條帶；20 份鐵皮石斛品系間Jaccard相似系數(shù)為0.002-0.821，顯示出供試鐵皮石斛有較為豐富的遺傳變異；同時，構(gòu)建出20份鐵皮石斛品系的SRAP特征指紋圖譜。

靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（Target region amplification polymorphism，TRAP）標(biāo)記技術(shù)是從SRAP標(biāo)記技術(shù)改進而來，基于已知的cDNA或表達序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）序列信息，較易將性狀與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)，具有操作簡單、效率高、共顯性、重復(fù)性好和易測序等優(yōu)點［25］。劉玲等［26］利用鐵皮石斛多糖生物合成途徑中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因以及石斛堿合成過程中苯丙氨酸解氨酶基因，設(shè)計構(gòu)建TRAP分子標(biāo)記，對鐵皮石斛野生居群及其雜交后代進行鑒別。最終從54 對TRAP引物中共篩選出7 對引物，可用于鑒別鐵皮石斛野生居群，并且在雜交后代中可同時檢測到親本特征條帶和新產(chǎn)生條帶，可有效地鑒別出親本及其雜交后代。

1.1.3 SSR標(biāo)記及相關(guān)技術(shù) SSR標(biāo)記技術(shù)又名微衛(wèi)星技術(shù)［27］，由于具有高度可變性、可重復(fù)性、共顯性、特異性及技術(shù)難度低，且在全基因組中隨機分布等優(yōu)點［28］，在分子鑒定中應(yīng)用較多。謝明璐等［29］利用該技術(shù)成功開發(fā)出4 對引物，能夠?qū)﹁F皮石斛種質(zhì)純度進行鑒定。徐蕾等［30］對36 份來自云南、浙江、廣東、廣西等地的鐵皮石斛進行SSR分析，共獲得249 個SSR標(biāo)記位點，遺傳分析發(fā)現(xiàn)供試的中國鐵皮石斛品種具有較高的遺傳多樣性。Hou等［31］設(shè)計三核苷酸SSR標(biāo)記對鐵皮石斛遺傳多樣性進行分析，最后成功獲得15 個新的SSR標(biāo)記。Xu等［32］對來自4 個自然居群的55 個鐵皮石斛植株的多態(tài)性水平進行測定。從設(shè)計的15 對葉綠體（Chloroplast，cp）SSR引物中找到9 對具有多態(tài)性。在另一組51個石斛屬個體（屬于17 種不同物種）上驗證9 對cp SSR引物的可轉(zhuǎn)移性，發(fā)現(xiàn)3 種標(biāo)記物可以轉(zhuǎn)移到所有測試的物種，而其余的6 種標(biāo)記物在大多數(shù)測試物種中可成功交叉擴增。Xu等［33］對2個鐵皮石斛栽培品種的2 年生莖進行轉(zhuǎn)錄組測序。共獲得51 683 個的全長轉(zhuǎn)錄本，平均長度為505 bp，獲得40 405 個非重復(fù)序列基因（Unigenes）。從7 332個（18.15%）Unigene序列中共鑒定出8 527 個潛在SSRs，其中1 023 個（2.53%）Unigenes含有多于一個的SSR標(biāo)記。此外，還設(shè)計了68 個基因座特異性引物對，其中17 對可產(chǎn)生多態(tài)性產(chǎn)物。由于它們具有高度的多態(tài)性和可轉(zhuǎn)移性，這些基因型SSR標(biāo)記不僅可用于石斛種質(zhì)資源保存，而且還可用于石斛的系統(tǒng)發(fā)育研究。

基于SSR標(biāo)記技術(shù)，簡單重復(fù)序列間（Intersimple sequence repeat，ISSR）的DNA標(biāo)記技術(shù)得以開發(fā)，它具有耗資少、DNA用量少和多態(tài)性高的優(yōu)點，且無需知道任何靶標(biāo)記的序列背景。Shen等［34］利用該技術(shù)鑒定8 個鐵皮石斛居群，從76 對設(shè)計的ISSR引物中篩選到10 對引物，擴增出127 個DNA片段，多態(tài)性條帶為90.5%，最終找到16 個特定的鑒別標(biāo)記。為了提高鑒別效率，使用6 個多態(tài)性條帶來構(gòu)建ISSR指紋識別碼，用于驗證鐵皮石斛居群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛8 個野生居群均可采用ISSR準(zhǔn)確鑒定。Ding等［35］利用RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)對9個野生的鐵皮石斛居群進行遺傳多樣性分析，得到89%的多態(tài)性條帶，結(jié)合分子方差分析法（Analysis of molecular variance，AMOVA）發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)存在78.88%（RAPD）和78.84%（ISSR）的種間變異，居群間變異與地域無顯著相關(guān)性。9 個鐵皮石斛野生居群具有豐富的遺傳多樣性，并且ISSR的多樣性檢測優(yōu)于RAPD。

隨機擴增微衛(wèi)星多態(tài)性（Random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）標(biāo)記技術(shù)是一種結(jié)合SSR與RAPD優(yōu)點而發(fā)展起來的新標(biāo)記技術(shù)，具有共顯性特點，不需要開發(fā)特異性引物，多態(tài)性豐富，重復(fù)性強，分析較為簡便［36］。能更好的揭示物種間的親緣關(guān)系，且更適合于遺傳背景尚不太清楚物種的遺傳多樣性研究。沈潔等［37］設(shè)計出16 對引物，利用RAMP標(biāo)記技術(shù)對9 個野生居群的112株鐵皮石斛進行檢測發(fā)現(xiàn)，不同居群間存在較豐富的遺傳多樣性。對RAMP擴增條帶數(shù)據(jù)進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛居群地理分布的遠(yuǎn)近與居群間遺傳關(guān)系的親疏呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

1.1.4 AFLP標(biāo)記及相關(guān)技術(shù) AFLP標(biāo)記技術(shù)1992年由Zabeau等［38］創(chuàng)立，較之前的標(biāo)記技術(shù)，其可信度、靈敏度和經(jīng)濟實用等方面都有了較大的提升。王慧中等［39］采用AFLP標(biāo)記技術(shù)，選擇3 種擴增引物組合分別對13 種石斛屬植物進行擴增，獲得豐富的條帶。著重分析了100-300 bp之間的條帶，共獲得346 條譜帶，多態(tài)條帶比率為98.8%，說明供試石斛屬植物有著豐富的遺傳多樣性。聚類分析表明，在相似系數(shù)0.54處，可將13 種材料分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，其中鐵皮石斛分屬于Ⅰ類。AFLP分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果基本一致，表明該技術(shù)可用于對石斛屬植物的遺傳多樣性和分類研究。Li等［40］采用該技術(shù)對12 個鐵皮石斛居群進行AFLP分析。結(jié)合POPGENE軟件和AMOVA分析檢測到高水平的遺傳多樣性（He = 0.269），發(fā)現(xiàn)ΦST值在0.047-0.578范圍內(nèi)的居群間存在中等變異，平均遺傳變異為26.97%。非加權(quán)平均距離法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）樹狀圖顯示3 個主要聚類，這與使用NTSYS軟件進行主坐標(biāo)分析的結(jié)果一致。提示保持一個穩(wěn)定的環(huán)境對于這種珍稀瀕危植物的原生境保存和管理至關(guān)重要，對于非原生境保存來說，設(shè)計一個完整的種質(zhì)資源庫非常有意義。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的基本方式之一，DNA甲基化與基因沉默有關(guān)，去甲基化可導(dǎo)致基因表達。隨著對DNA甲基化研究的深入，在AFLP標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）標(biāo)記技術(shù)，它操作相對簡單，多態(tài)性高，引物設(shè)計也相對容易，可檢測出樣品DNA中大量的甲基化位點。李雅婷等［41］采用AFLP和MSAP標(biāo)記技術(shù)，探討鐵皮石斛二倍體經(jīng)染色體加倍后得到四倍體的過程中，遺傳差異和基因組DNA甲基化水平及模式變化情況，分析鐵皮石斛二倍體與同源四倍體的基因組變異及甲基化差異。AFLP結(jié)果顯示，在25 對引物組合擴增的1 006 條帶中，多態(tài)條帶比率為47.12%；甲基化模式分析顯示，鐵皮石斛同源四倍體有28.63%的位點發(fā)生了去甲基化，30.63%的位點發(fā)生了過甲基化。鐵皮石斛同源四倍體DNA堿基序列同其二倍體相比，總甲基率低，且甲基化模式也發(fā)生了較大調(diào)整。這為進一步探索四倍體鐵皮石斛的表觀遺傳調(diào)控機制與基因組變異機理奠定了基礎(chǔ)。關(guān)蕾等［42］利用MSAP標(biāo)記技術(shù)研究了強光脅迫下鐵皮石斛抗氧化系統(tǒng)與基因組DNA甲基化水平受外源硫化氫的影響發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L的硫氫化鈉（硫化氫的供體）可顯著提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活力，同時降低丙二醛的含量，以此來緩解鐵皮石斛在強光脅迫下造成的氧化損傷。高濃度硫氫化鈉（600 μmol/L）則會加重鐵皮石斛的氧化損傷。MSAP分析表明，同對照鐵皮石斛35.4%的基因組DNA甲基化比率相比，強光脅迫下0、200和600 μmol/L硫氫化鈉處理（T1、T3和T5）的甲基化比率均低。T1與對照相比、T3和T5與T1相比，鐵皮石斛基因組DNA的去甲基化和甲基化變化位點的比例分別為6.4%、7.7%、6.7%和9.0%、8.1%和9.2%。通過對差異條帶進行回收測序和Blast比對發(fā)現(xiàn)，其中有與光合作用有關(guān)的合成酶、與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等同源的片段。

1.1.5 SCoT標(biāo)記技術(shù) SCoT標(biāo)記是Collard和Mackill［43］以單引物擴增反應(yīng)（Start codon targeted polymorphism，SPAR）為基礎(chǔ)開發(fā)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，它根據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計單引物并對其基因組進行擴增，多態(tài)性豐富，且操作簡單［44］。趙瑞強等［45］利用正交試驗設(shè)計與單因素實驗的方法，對鐵皮石斛SCoT-PCR反應(yīng)體系進行了構(gòu)建和優(yōu)化，以32 份鐵皮石斛葉片為實驗材料，驗證發(fā)現(xiàn)該體系在遺傳多樣性分析中具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。徐旭棟等［46］采用單一變量控制的方法獲得鐵皮石斛SCoTPCR 20 μL的優(yōu)化反應(yīng)體系。這些研究為鐵皮石斛種質(zhì)遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供了反應(yīng)體系。隨后，徐旭棟等［47］對20 份不同來源的人工栽培鐵皮石斛樣品進行SCoT分析。從設(shè)計好的56 對SCoT引物中最終篩選出20 對，共獲得226 個擴增條帶，總多態(tài)條帶比率為90.3%。表明不同來源的人工栽培種鐵皮石斛存在較大的遺傳變異，提示目前市場中的人工栽培鐵皮石斛具有豐富的遺傳多樣性，SCoT標(biāo)記技術(shù)可用于鐵皮石斛的遺傳多樣性研究。

1.1.6 基因芯片技術(shù) 基因芯片（也叫DNA微陣列）［48］可以利用特異性探針高通量地鑒別鐵皮石斛的真?zhèn)?。Zhang等［49］利用已有的16 種石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列，設(shè)計出帶有熒光標(biāo)記的ITS2序列探針，利用基因芯片技術(shù)鑒定《中國藥典》中收錄的5 種藥用石斛，可以對不同石斛種類實現(xiàn)有效區(qū)分。Sze等［50］利用5S rDNA基因間隔區(qū)序列，設(shè)計特異性熒光探針，以此開發(fā)出商業(yè)化基因芯片，可以有效區(qū)分鐵皮石斛與其他種類的石斛。然而，基因芯片可以從遺傳水平鑒別中藥品種，但中藥藥效成分大多為次生代謝產(chǎn)物，基因芯片無法對中藥的優(yōu)劣進行鑒別，因此需與中藥的化學(xué)成分指紋圖譜等鑒定相結(jié)合，來評價鐵皮石斛藥用價值的優(yōu)劣，發(fā)揮最佳作用［51-52］。

除了上述提到的標(biāo)記技術(shù)，利用鐵皮石斛的其他分子標(biāo)記基因也可以實現(xiàn)鑒定的目的，如核基因組的rRNA、ITS，葉綠體基因組的rbcL、matK、rpoC，以及線粒體的nad1基因內(nèi)含子等。丁小余等［53］通過擴增、測序21 種楓斗類石斛的rDNA ITS，初步建立出一個小型楓斗石斛的rDNA ITS數(shù)據(jù)庫。Ding等［54］基于38 種石斛的rDNA ITS序列，設(shè)計出一對特異性PCR引物TP-JB01S和TP-JB01X，66℃退火時，只有鐵皮石斛得以特異性擴增，可以快速有效地鑒定鐵皮石斛。滕艷芬等［55］利用matK基因序列比較了《中國藥典》收錄的石斛和市場中常見的混淆品種發(fā)現(xiàn)，matK基因序列在非石斛屬混淆品與正品石斛之間的差異要遠(yuǎn)大于正品石斛間的差異。Ding等［56］利用葉綠體基因matK和rbcL、核rDNA ITS區(qū)和線粒體基因nad1內(nèi)含子序列對8 個鐵皮石斛居群進行研究。除了在rDNA ITS區(qū)域發(fā)現(xiàn)9 個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點之外，居群間matK、rbcL和nad1內(nèi)含子序列中沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。設(shè)計兩對基于SNP等位基因特異性的PCR引物來驗證兩個真實群體——GSG和FSC。GSG和FSC的等位基因特異性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）片段大約為600和560 bp，退火溫度分別在55-57℃和58-60℃。這兩對引物同樣也可以對來自真實群體的干燥的“楓斗”樣品進行鑒定。

1.2 遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化可以實現(xiàn)外源基因定向?qū)胧荏w細(xì)胞，是研究基因功能、分子改良的重要基因工程技術(shù)。按照作用方式不同，鐵皮石斛的遺傳轉(zhuǎn)化可分為間接轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法和直接轉(zhuǎn)化的基因槍法。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系已建立并進行了不斷地優(yōu)化。武榮花等［57］用農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACO反義基因?qū)﹁F皮石斛原球莖（Protocormlike bodies，PLBs）進行遺傳轉(zhuǎn)化，找到優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件：經(jīng)刀切法處理的PLBs，在乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）濃度為100 μmol/L、農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0.8的條件下侵染30 min，共培養(yǎng)60 h，接種到含有30 mg/L美羅培南（Meropenem，Mer）和3.0 mg/L草甘膦（Glyphosate，PPT）的篩選培養(yǎng)基中，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。篩選獲得的抗性植株經(jīng)β-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）組織化學(xué)染色和PCR鑒定，初步證明ACO反義基因已整合到鐵皮石斛基因組中。崔波等［58］以鐵皮石斛PLBs為受體，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，經(jīng)摁壓處理的PLBs，在AS濃度為200 μmol/L、農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為1.0的條件下侵染30 min，共培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入到含有50 mg/L Mer和2.0 mg/L PPT的篩選培養(yǎng)基中，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和PCR分析鑒定，初步證明ACC合成酶反義基因已成功整合到鐵皮石斛的基因組中。

除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)也在石斛中有應(yīng)用。Kuehnle和Sugii［59］以石斛蘭（Dendrobium× Jaquelyn Thomas雜交種）的 PLBs為受體，用含有植物可表達的Nos-NPT II基因和番木瓜環(huán)斑病毒（PRV）外殼蛋白（CP）基因的質(zhì)粒pGA482GG/cpPRV4微粒進行轟擊，得到來自4 個雜交系大約280 個原球莖，經(jīng)過卡那霉素篩選培養(yǎng)和PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，來自兩個雜交系的13 株抗性植株帶有Nos-NPT II基因，其中1 株同時帶有PRVCP基因。Chia等［60］利用熒光素酶基因（Luc）作為組合標(biāo)記/報告基因，成功對石斛蘭進行了基因槍法轉(zhuǎn)化。用1.3 μm由鎢包覆、攜帶有35SLuc嵌合基因的質(zhì)粒顆粒對石斛蘭類PLBs進行轟擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)過熒光顯微成像技術(shù)與Southern印跡分析證實Luc基因整合到石斛蘭基因組中。楊雪飛等［61］以鐵皮石斛PLBs為受體，利用基因槍法將來源于大麥的抗旱耐鹽基因lea3進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過PPT篩選檢測和PCR鑒定，證明lea3基因已整合到6個株系7株鐵皮石斛轉(zhuǎn)化株的基因組中。這兩種遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，有助于鐵皮石斛基因功能的鑒定，可依照實驗實際需求選擇。

2 鐵皮石斛基因組

2.1 基因組

基因是生物遺傳的基本單位，基因組測序技術(shù)的問世，讓人們可以從基因?qū)用嫒嫔钊氲亟沂旧矬w的秘密。蘭科植物占所有種子植物種類的10%左右，具有很大的經(jīng)濟價值，因其極具觀賞性和良好的生態(tài)適應(yīng)性而具有特殊的科學(xué)價值。Yan等［62］以云南省普洱地區(qū)可追溯來源的F3代人工自交型鐵皮石斛為材料，整合二代Illumina和三代PacBio兩大測序平臺的優(yōu)勢，2015年首次從頭組裝出1.35 Gb的鐵皮石斛基因組序列，雜合性0.48%。共預(yù)測到35 567 個蛋白質(zhì)編碼基因，所有的測序量合計覆蓋超過了鐵皮石斛基因組94%的序列，功能注釋到鐵皮石斛大約97.56%的蛋白質(zhì)編碼基因（34 699 個）。分析發(fā)現(xiàn)蘭花有著完整的花序基因集，相比于其他單子葉植物，鐵皮石斛具有特異的花序基因。與真菌共生和抗旱性有關(guān)的一些基因家族發(fā)生了明顯擴張。另外，對鐵皮石斛藥用成分生物合成信號通路進行分析發(fā)現(xiàn)，與多糖生成相關(guān)的基因SPS和SuSy發(fā)生大規(guī)模復(fù)制，鐵皮石斛石斛堿的合成信號通路可以從已有的研究結(jié)果基礎(chǔ)上延伸到16-epivellosimine 的合成［63］。

但Yan等［62］報道的鐵皮石斛的基因組序列，有著高度分散的裝配，K-mer分析中存在多個峰，表明其序列可能源自人造雜種，這復(fù)雜化了鐵皮石斛基因組的正確解讀。Zhang等［64］于2016年對石生蘭花——鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）基因組序列進行了報道。這兩篇報道的研究對象均為鐵皮石斛（表1），只是在學(xué)名叫法上有爭議，后者認(rèn)為鐵皮石斛的學(xué)名應(yīng)為Dendrobium catenatumLindl.［65］，對于鐵皮石斛的拉丁學(xué)名問題，有必要進一步商榷，本文暫不做過多探討。Zhang等［64］研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛與蝴蝶蘭（Phalaenopsis）擁有幾乎相同的基因數(shù)，共享全基因組重復(fù)，為二倍體，基因組大小1.01 Gb，含有38 條染色體，共預(yù)測到28 910 個蛋白編碼基因。分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛基因組中有許多抗性相關(guān)基因發(fā)生了擴張，表明其具有一個用以適應(yīng)廣泛生態(tài)位的強大免疫系統(tǒng)。涉及葡甘聚糖合酶活性基因的大量重復(fù)，可能與藥用多糖的合成相關(guān)。參與調(diào)控發(fā)育和生長的MADS-box基因cladesANR1、StMADS11和MIKC*均有不同程度擴張，表明這些擴張可能與石斛屬植物形態(tài)具有高度的多樣性有關(guān)。相反，I型MADS-box基因家族的基因缺失，可能解釋了種子胚乳的喪失。與其他植物基因組相比，鐵皮石斛擁有更多的長基因和許多獨特的重復(fù)。長末端重復(fù)序列（Long rerminal repeats，LTRs）占大約基因組的46%，通過計算它們的插入次數(shù)，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛在過去的500萬年中出現(xiàn)了一系列LTR活性，因此推斷這些LTR是從蝴蝶蘭屬的物種中被插入到鐵皮石斛基因組中的。

表1 鐵皮石斛基因組特征

鐵皮石斛基因組圖譜的成功繪制，使鐵皮石斛研究邁入了基因時代，不僅改變了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)光憑經(jīng)驗發(fā)展的現(xiàn)狀，而且為人工合成藥用鐵皮石斛活性成分奠定了分子基礎(chǔ)，為品種鑒定、基因育種、成分和功能研究，以及藥用成分的開發(fā)利用提供了重要資源，同時對珍稀食藥兩用植物的保護和優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源品種優(yōu)化也有重要意義。

2.2 葉綠體基因組

和全基因組不同，cp基因組相對較短（75-250 kb之間），主要為母本遺傳［66］，且大多數(shù)陸地植物的cp基因組含有高水平的插入和缺失，堿基置換的高發(fā)主要集中在特定基因和基因間隔上［67］。此外，完整的cp基因組具有大大超過常用DNA條形碼長度的保守序列，可提供更多的差異來區(qū)分密切相關(guān)的植物，從而使其成為超級條形碼［66］。cp基因組已成為研究植物物種鑒定、分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析進化的常用方法。

Luo等［68］和 Yang等［69］均對鐵皮石斛的 cp 基因組進行了報道，測序拼接后得到的結(jié)構(gòu)一致，只是在片段大小與基因數(shù)目等方面略有不同（表2）。鐵皮石斛cp DNA是一個長的環(huán)狀分子，由一個大單拷貝區(qū)（Large single copy，LSC）、一個小單拷貝區(qū)（Small single copy，SSC）和一對反向重復(fù)序列（Inverted repeat sequence，IR）組成，其中兩個IR將LSC和SSC隔離開。Luo等［68］還運用比較基因組的方法，對7 種光合蘭花的cp基因組（大花杓蘭，Cypripedium Macranthos；硬葉蘭，Cymbidium mannii；D. officinale； 扇 葉 文 心 蘭，Erycina pusilla；文心蘭，Oncidium Gower Ramsey；蝴蝶蘭，Phalaenopsis aphrodite；小蘭嶼蝴蝶蘭，Phalaenopsis equestris）進行對比分析發(fā)現(xiàn)，它們在結(jié)構(gòu)、基因順序和含量方面顯示出較高的相似性，只在反向重復(fù)/小單拷貝接合點和ndh基因上存在些許差異。

表2 鐵皮石斛葉綠體基因組特征

3 鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組可以高效全面地快速挖掘基因的表達、結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控機理，已經(jīng)成為是食藥用植物分子生物學(xué)領(lǐng)域較為成熟的研究手段。吳超等［70］應(yīng)用高通量測序技術(shù)對鐵皮石斛兩年生葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得11.15 Gb數(shù)據(jù)，GC含量47.77%。組裝后獲得121 596 個Unigenes，平均序列長度660 bp，功能注釋到52 345 個Unigenes?；虮倔w（Gene ontology，GO）分析將Unigene功能分類分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的3 大類57 個分支。蛋白質(zhì)直系同源（Protein orthologous group，COG）數(shù)據(jù)庫分析將40 842 個Unigene功能注釋后分到25 類直系同源蛋白分類中，主要涉及如復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成等過程。京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析發(fā)現(xiàn)，Unigene可定位到脂類代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等128 個代謝途徑分支上。Meng等［71］通過結(jié)合RNA、小RNA（Small RNA，sRNA）和降解組測序技術(shù)對鐵皮石斛進行了轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)器官特異性的研究。對鐵皮石斛4 個器官（花、葉、莖和根）進行RNA測序，共獲得536 558 個組裝好的轉(zhuǎn)錄本，其中鑒定出2 645、256、42和54 個轉(zhuǎn)錄本分別在4 個器官中高度表達。基于sRNA測序，鑒定出2 038、2、21和24 個sRNA分別特異性累積在4 個器官中。共檢測到1 047 個成熟的候選微RNA（MicroRNA，miRNA）?；诙壗Y(jié)構(gòu)預(yù)測和測序數(shù)據(jù)，從裝配的轉(zhuǎn)錄本中鑒定出幾十種潛在的miRNA前體。針對候選miRNA進行目標(biāo)鑒定，發(fā)現(xiàn)1 257 個miRNA靶基因。該研究初步建立起涉及鐵皮石斛生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)、次生代謝和Argonaute1（AGO1）蛋白調(diào)控相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)，為之后更深層次的分子研究夯實了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

鐵皮石斛作為我國重要的傳統(tǒng)中藥材，藥用有效成分主要為一些植物次生代謝產(chǎn)物，如石斛堿（生物堿）、石斛多糖、石斛酚、氨基酸、芪類及其衍生物及揮發(fā)性成分等［72-73］。其中石斛堿是石斛類植物特有的，具有抗腫瘤、止疼、解毒、降低心率、血壓和減慢呼吸、對心血管、胃腸道有抑制作用及止痛退熱等作用，可產(chǎn)生中度的高血糖，且可解巴比妥中毒［74］。Guo等［75］對鐵皮石斛莖利用 Roche 454平臺進行測序，得到553 084 個ESTs。組裝后獲得36 407 個獨特的推測轉(zhuǎn)錄本，共注釋出69.97%的獨特序列，獲得了生物堿生物合成的詳圖?；贙EGG功能分析找到69 個獨特序列，代表了涉及石斛堿骨架合成的25 個基因。實時熒光定量PCR（Real time quantitative PCR，RT-qPCR）驗證發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛葉片中5 個石斛堿合成關(guān)鍵酶基因的表達水平高于莖。篩選出細(xì)胞色素P450s、氨基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、多藥耐藥（Multidrugresistance，MDR）轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子可能參與石斛堿的合成。研究中的39 個ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄本包括11 個MDR轉(zhuǎn)運蛋白，這是首次在鐵皮石斛中發(fā)現(xiàn)MDRs。另外，從36 407 個Unigenes中檢測到1 061 個SSR，二核苷酸重復(fù)是最豐富的重復(fù)類型，其中，179 個基因與KEGG中的代謝途徑有關(guān)，這為建立新的SSR標(biāo)記提供豐富的DNA序列來源。

除石斛堿外，石斛多糖也是主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強免疫功能等活性［76-77］，一直是藥食同源植物領(lǐng)域中的研究熱點。Zhang等［78］為了鑒定可能與多糖合成有關(guān)的基因，從鐵皮石斛幼苗期和成苗期構(gòu)建了2 個cDNA文庫，分別命名為石斛-1和石斛-2。2 個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫整合后獲得共計145 791 個Unigenes，17 281個Unigenes注釋到126 個KEGG通路上，其中135個Unigenes參與果糖和甘露糖代謝；GO分析顯示大多數(shù)基因與代謝和細(xì)胞過程有關(guān)。找到430 個糖基轉(zhuǎn)移酶和89 個纖維素合成酶相關(guān)基因。分析比較石斛-2與石斛-1，共發(fā)現(xiàn)32 794 個差異表達基因（Differential expression gene，DEGs），基因上調(diào) 22 051 個、下調(diào)10 743 個。在石斛-1和石斛-2中分別有1 142 個和7 918 個Unigenes特異性表達，這些DEGs主要與代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成有關(guān)，其中170 個DEGs屬于糖基轉(zhuǎn)移酶基因，37個DEGs屬于纖維素合酶基因，627 個DEGs編碼轉(zhuǎn)錄因子。He等［79］利用4 個數(shù)字基因表達譜分析，對溫室栽培下鐵皮石斛莖中的甘露聚糖生物合成相關(guān)基因進行研究?；诟事毒厶欠e累和基因表達水平，從DEGs數(shù)據(jù)庫中鑒定出8 個與甘露聚糖生物合成相關(guān)的類纖維素合成酶基因（Cellulose synthaselike protein A，CSLA）。為了進一步分析這些CSLA基因，通過cDNA末端的快速擴增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）獲得每個基因的全長cDNA，發(fā)現(xiàn)這8 個基因?qū)儆贑esA超家族的CSLA家族，含有CesA超家族的保守結(jié)構(gòu)域，并且絕大多數(shù)基因在鐵皮石斛莖中高表達，與非生物脅迫有關(guān)。表明鐵皮石斛的CSLA家族基因參與生物活性甘露聚糖的生物合成。

Shen等［80］綜合測定并比較了鐵皮石斛不同器官中石斛堿和石斛多糖的含量。對根、莖、葉和花進行了轉(zhuǎn)錄組測序，基于GO和KEGG分析，確定出同參與果糖和甘露糖代謝酶有關(guān)的Unigenes以及與石斛堿生物合成途徑中推測的上游元件相關(guān)的Unigenes。鑒定到大量的候選基因，包括35 個全長糖基轉(zhuǎn)移酶基因和49 個全長P450基因，并確定了這些基因的器官特異性表達模式。

He等［81］對鐵皮石斛中的選擇性剪接異構(gòu)體和有關(guān)鐵皮石斛從葉片到莖的糖易位信息進行了研究。分析鐵皮石斛葉和莖中的多糖含量，利用二代測序和單分子實時（Single molecule real time，SMRT）測序技術(shù)完成了這2 種組織的轉(zhuǎn)錄組測序，得到基因和mRNA同種型表達數(shù)據(jù)。分析比較2 個轉(zhuǎn)錄組共發(fā)現(xiàn)1 414個DEGs，其中上調(diào)844個，下調(diào)570個。在這些基因中，一種糖最終輸出轉(zhuǎn)運蛋白（Sugar will eventually be exported transporter，SWEET）［82］和一種糖轉(zhuǎn)運蛋白（Sucrose transporters，SUT）［83］在鐵皮石斛莖中表達程度比葉中高。2 種糖基轉(zhuǎn)移酶和4 種纖維素合酶基因經(jīng)歷不同程度的選擇性剪接。在莖中，多糖含量是葉中的兩倍。找到另外兩個基因DoSWEET4和DoSUT1在莖中顯著表達，它們可能參與糖在韌皮部的裝載。Wu等［84］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)，基于生理特征分析揭示在鐵皮石斛幼苗生長過程中對低溫馴化（Cold acclimation）的響應(yīng)。這些研究極大擴充了鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組信息庫，為進一步篩選鑒定參與主要活性物質(zhì)生物合成的候選基因，以及揭示其代謝通路與合成機制提供了可能。

4 鐵皮石斛蛋白質(zhì)組與代謝組

4.1 蛋白質(zhì)組

賴氨酸琥珀酰化是各種真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中普遍存在且重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。然而，其在高多糖含量的鐵皮石斛中的功能在很大程度上是未知的。Feng等［85］將液相色譜-二級質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/ MS）技術(shù)用于鑒定通過用高效琥珀酰賴氨酸抗體免疫純化富集的肽。共鑒定207 種蛋白質(zhì)中的314 個賴氨酸琥珀酰化位點。GO分析表明，這些蛋白質(zhì)與廣泛的細(xì)胞功能相關(guān)，從代謝過程到應(yīng)急反應(yīng)過程均有涉及。此外，還鑒定了2 種保守的琥珀?；颉?**Ksuc******K**”和“****EKsuc***”（*表示隨機氨基酸殘基；Ksuc表示琥珀?；?K）。數(shù)據(jù)顯示賴氨酸琥珀?；l(fā)生在糖酵解途徑中的5 種關(guān)鍵酶上，這5 種酶在植物上的平均琥珀酰化位點數(shù)目低于細(xì)菌和哺乳動物。2個活性位點氨基酸殘基K103和K225可以在果糖二磷酸醛縮酶中被琥珀?；?，表明賴氨酸琥珀?；谡{(diào)節(jié)糖酵解酶活性中具有潛在功能。琥珀酰化蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)表明，它們可能參與包含有糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和核糖體等幾個功能項。這首次證明琥珀?；瘏⑴c糖酵解過程，并且可能加速琥珀?；铣勺鳛橹饕钚猿煞值亩嗵呛铣傻奈磥砩飳W(xué)研究。

4.2 代謝組

由于鐵皮石斛起作用的大多是代謝產(chǎn)物，因此，研究其代謝組在中藥材的鑒定、質(zhì)量控制上有應(yīng)用意義。Jin等［86］在甲醇/水相中分離了不同生長年限的栽培鐵皮石斛和霍山石斛莖中的代謝物，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對其進行鑒定。石斛甲醇/水相中的代謝產(chǎn)物主要為糖類和糖苷類、氨基酸類、有機酸類和醇類。通過聚類分析，結(jié)合多因素統(tǒng)計分析手段，對鐵皮石斛、霍山石斛以及它們不同的生長年限進行了區(qū)分。其中11 種代謝物（包括蔗糖、葡萄糖、半乳糖、琥珀酸鹽、果糖，十六烷酸鹽、油酰腈、肌醇和甘油等）對這種分化有顯著貢獻（P＜ 0.05）。石斛化學(xué)成分的代謝譜分析表明，霍山石斛的多糖含量高于鐵皮石斛。此外，基于石斛蘭代謝物的積累，石斛的最佳收獲時間為第3年。

代謝組學(xué)除了可用于中藥材鑒定和質(zhì)量控制外，還能夠探究復(fù)雜的生命過程。植物低溫馴化是一種涉及基因調(diào)控和表達的基因復(fù)雜現(xiàn)象。鐵皮石斛是一種重要的食藥用植物且兼具觀賞價值，對低溫敏感，是研究低溫馴化的理想材料。Wu等［84］利用大規(guī)模代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄技術(shù)，基于生理特征分析揭示了鐵皮石斛幼苗對低溫馴化的響應(yīng)。當(dāng)溫度由4℃降至-2℃時，24 h內(nèi)抗氧化酶活性和電解質(zhì)滲漏均顯著升高（P＜ 0.01）。根據(jù)生理學(xué)分析，首次獲得了0℃和20℃下20 h內(nèi)的最適低溫馴化點。發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛在低溫馴化期發(fā)生大量的轉(zhuǎn)錄組和代謝組重編程。從基因到代謝物網(wǎng)絡(luò)分析均表明鐵皮石斛的低溫馴化是一種通過激活糖酵解、氨基酸分解代謝和三羧酸循環(huán)的高能量需要過程。鐵皮石斛中有2 767 個基因的表達水平受低溫馴化顯著影響，其中CBF轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)153 倍，胞質(zhì)級聯(lián)蛋白激酶MAPKKK 16上調(diào)56 倍。運用低溫和對照每個樣品10 個平行樣本的原則，采用GC-MS技術(shù)對代謝產(chǎn)物譜進行分析，在鐵皮石斛葉片中共識別出68 個代謝物，其中33 個顯示出差異性積累（27 個上升，6 個下降）。基因相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，低溫馴化作為一個活躍的過程，受轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后水平的嚴(yán)格調(diào)控。該研究提供了一個全面的調(diào)控機制，包括低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達，這有助于深入了解鐵皮石斛低溫馴化期間所發(fā)生的高度復(fù)雜的調(diào)控過程。此外，鐵皮石斛對于環(huán)境溫度的要求較高，最適溫度在25-28℃間［87］，主要生長地在我國南方地區(qū)，近些年，北方地區(qū)開始在溫室中栽培鐵皮石斛，但成本一直較高，如果可以低溫馴化鐵皮石斛，提高它的抗低溫性，將有利于將鐵皮石斛這一資源更好的引入北方市場。

5 總結(jié)

2015年，鐵皮石斛基因組得以破譯，標(biāo)志著鐵皮石斛分子生物學(xué)時代的開始，一系列關(guān)于鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等組學(xué)方面的研究也取得了可喜的成績。然而，還有很多問題亟待解決。例如，鐵皮石斛種子萌發(fā)生長需要借助某些真菌共生［88］，但現(xiàn)在的研究多是對于其相互作用的表型層面研究，其完整的互作機理、營養(yǎng)吸收和代謝機制等問題尚未明確。鐵皮石斛作為珍稀瀕危物種，借助全基因組數(shù)據(jù)與分子標(biāo)記技術(shù)，保護、鑒定和優(yōu)化種質(zhì)資源，建立完善的種質(zhì)資源分子遺傳圖譜和可追溯的原始檔案方面的工作亟待加強。此外，對于利用多組學(xué)技術(shù)結(jié)合新型的分子生物學(xué)手段，發(fā)掘鐵皮石斛特異和功能性基因資源的工作也需加速開展，這將幫助我們推進鐵皮石斛有益成分生物合成機制及合成生物學(xué)的研究進程。