• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離及其生物學特性

    2019-05-17 09:36:46徐敬昭陳貝杜秉海趙東英汪城墻丁延芹
    生物技術(shù)通報 2019年3期
    關鍵詞:鐵載體浸出液單胞菌

    徐敬昭 陳貝 杜秉海 趙東英 汪城墻 丁延芹

    (山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,泰安 271018)

    在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,大部分細菌雖然存在而且有明顯的生物學活性,但難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離,不同的微生物學家使用很多術(shù)語來描述這些細菌,包括“寡營養(yǎng)細菌”[1]和“活的不可培養(yǎng)(Viable but non-culturable,VBNC)細菌”[2]等。寡營養(yǎng)細菌數(shù)量巨大、種類繁多、基因資源豐富,因此開發(fā)此類微生物已成為國內(nèi)外研究熱點。現(xiàn)階段的研究策略主要分為兩大類:一方面不斷改進現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)技術(shù);另一方面結(jié)合生物化學和分子生物學的原理建立與發(fā)展非培養(yǎng)方法,如磷酸脂肪酸(Phosphohpids fattyacid,PLFA)分析、Biology微孔板法及宏基因組測序等[3]。

    雖然以組學為代表的非培養(yǎng)方法推動了微生物資源的挖掘與利用,但這類方法也存在一些問題:首先,很難在細胞水平上對微生物進行實驗研究,無法深入了解微生物細胞的生命活動規(guī)律;其次,很難科學地描述和驗證微生物群落中不同種群之間的相互作用關系。因此,在利用非培養(yǎng)方法研究微生物多樣性的同時,有必要不斷優(yōu)化現(xiàn)有微生物培養(yǎng)技術(shù),二者結(jié)合以幫助我們深入研究微生物生命活動規(guī)律并探索其重要的生物學功能,在真正意義上實現(xiàn)微生物資源的開發(fā)與利用。

    寡營養(yǎng)細菌難以分離的原因及應對策略:(1)少數(shù)易培養(yǎng)微生物的競爭性干擾。根據(jù)MacArthur提出的 “R-K選擇”理論,易培養(yǎng)細菌是環(huán)境中的“R 選擇”者,能在短時間內(nèi)迅速倍增。而寡營養(yǎng)細菌作為環(huán)境中占多數(shù)的“K 選擇”者,能對有限資源進行最有效地利用,保持極低的生長率,以適應生境中的低營養(yǎng)條件。利用傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基可對易培養(yǎng)細菌進行有效富集,然而其生長必然伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗以及有害代謝產(chǎn)物的積累,進而抑制多數(shù)寡營養(yǎng)細菌的生長,使得最終分離的不一定是生境中密度最高或發(fā)揮主要功能的細菌。Button等[4]使用稀釋培養(yǎng)法,即當把樣品中的微生物群體稀釋至痕量時,樣品中的“K 選擇”者可以不受“R 選擇”者的干擾,大大提高寡營養(yǎng)細菌被分離的可能性。(2)傳統(tǒng)培養(yǎng)基無法提供不同種類微生物生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)。自然界中微生物種類豐富,不同種類的微生物生長代謝類型不同,對反應的底物要求也存在差異。傳統(tǒng)培養(yǎng)基大大簡化了營養(yǎng)組成,無法提供不同微生物生長繁殖所必需的某些化學物質(zhì)。為彌補這一缺陷,通常將土壤浸出液添加到合成培養(yǎng)基中,但添加比例通常為1∶100-1 000[5-6],這在很大程度上稀釋了其中所含生長因子的有效濃度。(3)傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分相對豐富或氧化環(huán)境的壓力。1 g土壤中通常含有106-109個微生物細胞[7],分配到每一個微生物細胞,其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏,多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài),傳統(tǒng)分離方法通常將微生物迅速置于富營養(yǎng)狀態(tài),突然的營養(yǎng)變化凸顯了一些細菌固有的基因缺陷,甚至成為其生長的主要障礙。這其中就包括有毒物質(zhì)的形成,如半乳糖苷增多、氧代謝形成有毒產(chǎn)物或自由基積累過快不可逆轉(zhuǎn)的對部分細胞造成損傷。研究表明,丙酮酸鈉與過氧化氫酶能降解培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒性氧[8],對恢復微生物可培養(yǎng)性具有良好效果。

    植物根際往往存在一類被稱為植物根際促生菌[9](Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)的微生物,它們能通過固氮、溶磷、拮抗病原菌以及產(chǎn)生鐵載體、各類水解酶和植物激素等方式顯著促進植物生長[10]。寡營養(yǎng)細菌難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到,不僅僅是由于營養(yǎng)水平的限制,而是上述因素的綜合效應。因此,本研究基于稀釋培養(yǎng)法,直接使用土壤浸出液配制寡營養(yǎng)培養(yǎng)基,以更好地模擬土壤原生境的營養(yǎng)成分,同時輔以丙酮酸鈉和過氧化氫酶以降解毒性氧物質(zhì),來分離寡營養(yǎng)細菌,并通過測定其產(chǎn)生鐵載體能力以及降解蛋白質(zhì)能力探索菌株在農(nóng)業(yè)上的應用價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試植株選用黃瓜(Cucumis sativusL.)于山東農(nóng)業(yè)大學溫室培育,于2017年2月播種,4月定植,常規(guī)栽培管理,植株長勢良好,至8月采集根際土壤樣品。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)基 (1)土壤浸出液:土壤 50.00 g,去離子水 1 L,pH 自然,混勻后用四層紗布粗濾,4℃,10 000 r/min離心1 min,取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩#?)本實驗所設計4類培養(yǎng)基配方詳見表1,具體配制過程如下:1、2號培養(yǎng)基滅菌前成分相同,即只含土壤浸出液,因此將1×105Pa滅菌的土壤浸出液與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌的土壤浸出液等體積混合后,倒板;3號培養(yǎng)基滅菌前為使用土壤浸出液配制2% LB:胰蛋白胨 0.20 g,酵母提取物 0.10 g,NaCl 0.20 g,土壤浸出液 1 L,pH 自然,1×105Pa滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌土壤浸出液等體積混合,倒板;4號培養(yǎng)基滅菌前為使用去離子水配制1% LB:胰蛋白胨 0.10 g,酵母提取物0.05 g,NaCl 0.10 g,去離子水 1 L,pH 自然,1×105Pa滅菌20 min,倒板。(3)2.27 mol/L丙酮酸鈉溶液:丙酮酸鈉 0.25 g,去離子水 1 mL,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,吸取100 μL涂布于對應培養(yǎng)基平板上,使涂布平板最終含有0.125%的丙酮酸鈉。(4)1×107U/L過氧化氫酶溶液:過氧化氫酶 2.00 g,0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液 1 L,pH 7.0,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,吸取200 μL涂布于對應培養(yǎng)基平板上,使涂布平板最終含有2 000 U的過氧化氫酶。(5)CAS檢測培養(yǎng)基[11]。(6)干酪素培養(yǎng)基:干酪素 10.00 g,瓊脂15.00 g,去離子水 1 L,pH 7.4。(7)產(chǎn)蛋白酶細菌發(fā)酵培養(yǎng)基:干酪素 10.00 g,去離子水 1 L,pH 7.4。上述(5)-(7)培養(yǎng)基1×105Pa滅菌20 min。

    表1 培養(yǎng)基配方

    1.2.2 土壤樣品采集 2017年11月9日從山東農(nóng)業(yè)大學溫室(36°11'N,117°06'E)采集黃瓜的根際土壤樣品。經(jīng)多次預試驗后選稀釋度10-6-10-7的土壤懸液各取100 μL涂布于寡營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上,于37℃溫箱中培養(yǎng)。然后挑取不同形態(tài)的菌落,在平板上劃線分離單菌落并結(jié)合鏡檢至菌落形態(tài)單一為止,并對菌株進行編號,分別保藏于4℃和-20℃冰箱備用。

    1.2.3 菌株分離鑒定 菌落與細胞形態(tài)鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[12]。部分生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13],通過Biology微生物鑒定系統(tǒng)進行生長實驗與化學敏感實驗。利用基因組快速抽提試劑盒(生工SK8255)提取基因組,提取方法參照配套說明書。采用細菌16S rRNA 基因通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), 擴增片段長度約為1 500 bp;gyrB基因引物XgyrB1F(5'-ACGAGTACAACCCGGACAA-3') 和 XgyrB1R(5'-CCCATCARGGTGCTGAAGAT-3'),擴增片段長度約為700 bp。對提取的菌株基因組DNA進行PCR擴增,采用50 μL PCR擴增反應體系:模板1 μL,引 物(F)1 μL, 引 物(R)1 μL,5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL, 加 超 純水補足到 50 μL。反應程序為:95℃預變性2 min;95℃變性20 s;55℃退火20 s;72℃延伸1 min(gyrB30 s),30個循環(huán)后,72℃延伸5 min,PCR 擴增產(chǎn)物于4℃保存。對擴增后的產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?;蛐蛄杏缮虾I锕こ谭沼邢薰具M行測定,將所獲得序列利用BLAST比對分析,從NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中挑選相似性序列并得到序列號信息,運用MEGA7.0軟件生成N-J進化樹,分析同源性關系較近的菌株。

    1.2.4 菌株對植物促生功能的檢測 參照王君[14]的方法對菌株的蛋白酶和鐵載體產(chǎn)生能力進行測定,蛋白酶活性測定參照《微生物學實驗》[15]。其中,試驗所采用陰性對照為鏈狀副球菌(Paracoccus alkenifer),是本實驗室保存的一株無蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力的細菌。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株鑒定結(jié)果

    2.1.1 分離菌株的形態(tài)觀察結(jié)果 培養(yǎng)7 d后,本研究所設計的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為:1號培養(yǎng)基32個,2號培養(yǎng)基23個,3號培養(yǎng)基40個,4號培養(yǎng)基8個。根據(jù)菌落形態(tài)差異,從上述培養(yǎng)基上挑取菌落數(shù)較多、生長速度較慢得1類菌,用三區(qū)劃線法進行純化,將其命名為S35。通過細胞形態(tài)觀察及革蘭氏染色進行初步鑒定,S35為G-菌、無內(nèi)生孢子、短桿狀、菌落較小微凸呈黃色、表面光滑濕潤不透明(圖1)。

    2.1.2 菌株S35生理生化鑒定結(jié)果 本研究共測定了菌株S35的77項生理生化特性(表2),其中脲酶陰性,氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、脂酶和精氨酸雙水解酶陽性,利用L-丙氨酸、L-組氨酸、L-乳酸及檸檬酸,能夠利用葡萄糖、麥芽糖和乳糖產(chǎn)酸,與模式株S. maltophilia的生理生化結(jié)果一致。

    圖1 菌株S35革蘭氏染色

    2.1.3 菌株S35基因序列分析結(jié)果 菌株S35經(jīng)PCR擴增的16S rRNA基因片段大小為1 438 bp,在GenBank中進行序列比對分析,與Stenotrophomonas maltophilia(登錄號:FJ906801.1)一致性為100%;gyrB基因片段大小為695 bp,與S. maltophilia(登錄號:EU499066.1)一致性為100%。使用MEGA 7.0軟件通過N-J法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),S35菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌均處同一支,遺傳進化距離最近。

    其中,gyrB的基因序列為:GAATCATCATCAT GACCGACGCCGACGTCGACGGCGCCCACATCCGCA CCCTGCTGCTGACGTTCTTCTACCGTCAGATGCCGG AGCTGATCGAGCGCGGTTACGTCTACATCGGCCTG CCGCCGCTGTACAAGATCAAGCAGGGCAAGCAGGAGCTGTACCTGAAGGACGACCCGGCGCTGGACAGC TACCTGGCCAGCAGCGCAGTGGAAAACGCTGCACT GGTGCCGGCCACCGGCGAGCCCGGCATCGAAGGCC TTGCGCTGGAGAAGCTGCTGCTGGCCTACGCGGCC GCGCTGGATTCGATCGAGCGCAACGCACATCGCTAC GACCGCAACCTGCTTGAAGCGCTGGTCGATTTCGTA CCGATGGACCTGCTGCCGGTGAAGGCGAGGGCCTG GATGCACTGGCCAAGCGCCTCAACCAGGCCGCGCTT GCAGGAAGCCAACGACGAGCGCCCGGCCGCTGTGC TGGTGACCCGTCGCCACATGGGTGAACAGCACATCC AGGTGCTGCCGATGTCGGCCTTCGAAAGCGGCGAA CTGCGCGCAATCCACCAGGCATCGAAGCTGCTGCAC GGTCTGGTGCGACCATTTCCCGCGGTGCCAAGTCGA TCGAAGTCGACAGCTTTGCCAAGGCACAGAACTGG CTGCTCGAGGAGGCCAAGCGCGGCCGCCAGATCCA GCGATTCAAGG。

    表2 菌株S35生理生化實驗結(jié)果

    2.2 菌株S35蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力檢測結(jié)果

    將菌株S35接種到干酪素檢測培養(yǎng)基和通用CAS檢測培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)72 h后菌株周圍均出現(xiàn)明顯水解圈和顯色圈,根據(jù)其直徑大小可以判定S35產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力大小(圖3和表3),說明菌株S35具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。經(jīng)干酪素發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后菌株S35在40℃,pH 11的條件下測定的蛋白酶活力為36 U/mL。

    圖2 基于16S rRNA(A)和gyrB(B)基因序列構(gòu)建菌株S35系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

    表3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

    3 討論

    一般認為,自然環(huán)境中微生物數(shù)量龐大,其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏,多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài),且一些微生物適宜生長在與自然環(huán)境相近的基質(zhì)中[16]。因此,采用低營養(yǎng)或輔以含少量生長因子的土壤浸出液制成的培養(yǎng)基會獲得較好的培養(yǎng)效果[17]。通過比較本研究所設計的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù),可以看出丙酮酸鈉、過氧化氫酶以及土壤浸出液的使用確實可增加寡營養(yǎng)培養(yǎng)基上可培養(yǎng)的菌落數(shù),進一步證實上述推論。當然,我們應充分重視自然生境中微生物的分布可能是隨營養(yǎng)漸變而呈現(xiàn)梯度分布,所以培養(yǎng)策略不應是全營養(yǎng)或100%稀釋后的簡單選擇,后續(xù)研究應使用不同營養(yǎng)梯度來深入分析營養(yǎng)濃度對菌株分離的影響。

    研究表明[18-19],使用常見細菌培養(yǎng)基很難分離得到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。本研究發(fā)現(xiàn),嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在100% LB培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時,生長速度快、菌落較大且飽滿,推測其在通常情況下不易分離得到的原因是在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上受具有生長優(yōu)勢的細菌的干擾。因此,實驗采用稀釋培養(yǎng)法同時配合低營養(yǎng)物質(zhì)濃度確實可以分離獲得在傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基上不易分離的細菌。其中,土壤浸出液的使用最大限度模擬土壤原生境,因此更加有利于植物根際環(huán)境中優(yōu)勢菌的生長。

    本研究利用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基從黃瓜根際土壤中分離得到S. maltophiliaS35。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌,屬于黃單胞菌目黃單胞菌科。該菌于1958年首次分離發(fā)現(xiàn),1993年有學者根據(jù)其無黃單胞菌素,無植物病原性,且能在37℃生長等特性提議將此菌命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。2017年,Singh等[20]首次報道S. maltophiliaSBP-9具有ACC脫氨酶活性并在鹽脅迫下可賦予小麥全植株的耐受性,增強小麥對生物和非生物脅迫的抗性。因此,接下來我們將進一步探索此菌在植物根際促生方面的應用潛力。

    4 結(jié)論

    本研究利用土壤浸出液為基礎培養(yǎng)基,適當添加能夠降低活性氧的成分來分離土壤中寡營養(yǎng)微生物是一類行之有效的方法。利用上述方法從黃瓜根際土壤分離得到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌,該菌株具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。

    猜你喜歡
    鐵載體浸出液單胞菌
    微生物鐵載體的應用研究進展
    廢舊電池浸出液對銅錢草危害性的研究
    鐵載體細菌對植物缺鐵性黃化病生物防治的研究現(xiàn)狀
    微生物鐵載體轉(zhuǎn)運調(diào)控機制及其在環(huán)境污染修復中的應用
    枯草芽孢桿菌MB8兒茶酚型鐵載體的合成與結(jié)構(gòu)分析
    保溫材料浸出液成分及腐蝕性分析
    槲皮素改善大鼠銅綠假單胞菌肺感染
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:21
    持續(xù)性根尖周炎中牙齦卟啉單胞菌的分離與鑒定
    富錸渣雙氧水浸出液錸鉬分離工藝研究
    銅綠假單胞菌金屬酶及整合酶的檢測
    性色av乱码一区二区三区2| 啦啦啦免费观看视频1| 一区二区三区乱码不卡18| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产av新网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 另类亚洲欧美激情| 日韩免费av在线播放| 久热爱精品视频在线9| 亚洲色图av天堂| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 大码成人一级视频| 欧美黄色淫秽网站| 无人区码免费观看不卡 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产高清videossex| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精华国产精华精| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av电影在线进入| 亚洲视频免费观看视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 久热爱精品视频在线9| 手机成人av网站| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲色图综合在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 飞空精品影院首页| 日韩制服丝袜自拍偷拍| www.自偷自拍.com| 极品少妇高潮喷水抽搐| www.自偷自拍.com| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产深夜福利视频在线观看| 91麻豆av在线| 男人操女人黄网站| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产一区二区激情短视频| av视频免费观看在线观看| h视频一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 悠悠久久av| 三上悠亚av全集在线观看| 在线观看66精品国产| 少妇 在线观看| 亚洲国产欧美网| 一区二区三区国产精品乱码| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 色综合婷婷激情| 国产在视频线精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一区二区三区国产精品乱码| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 色尼玛亚洲综合影院| 少妇的丰满在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产一区二区 视频在线| av一本久久久久| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲avbb在线观看| 欧美中文综合在线视频| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久久久免费视频了| 午夜免费鲁丝| 丁香六月欧美| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 香蕉丝袜av| 成在线人永久免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 视频区欧美日本亚洲| 高清黄色对白视频在线免费看| 日韩人妻精品一区2区三区| 中文欧美无线码| 亚洲人成电影免费在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产色视频综合| 99久久国产精品久久久| 桃花免费在线播放| 黄色片一级片一级黄色片| 中文字幕人妻熟女乱码| 成人黄色视频免费在线看| 日韩有码中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 天天操日日干夜夜撸| 高清毛片免费观看视频网站 | 免费在线观看日本一区| 精品久久久精品久久久| 欧美日韩精品网址| 999久久久精品免费观看国产| 老熟女久久久| 精品一区二区三卡| 午夜福利一区二区在线看| 国产不卡av网站在线观看| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产三级黄色录像| 免费观看av网站的网址| 久久久久国内视频| 青草久久国产| 99热国产这里只有精品6| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 大型av网站在线播放| 久久久精品免费免费高清| 深夜精品福利| 亚洲人成77777在线视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产av又大| 首页视频小说图片口味搜索| av网站在线播放免费| 丰满迷人的少妇在线观看| 大片免费播放器 马上看| 成人永久免费在线观看视频 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 99久久精品国产亚洲精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91老司机精品| 午夜日韩欧美国产| 久久久久网色| 一区二区三区激情视频| 亚洲中文字幕日韩| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 男女无遮挡免费网站观看| 国产欧美日韩一区二区三| 免费在线观看完整版高清| 女性生殖器流出的白浆| 成年人免费黄色播放视频| 交换朋友夫妻互换小说| 一夜夜www| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av日韩在线播放| 十八禁人妻一区二区| 视频区图区小说| 欧美黄色淫秽网站| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 又紧又爽又黄一区二区| 妹子高潮喷水视频| 午夜免费成人在线视频| 99re6热这里在线精品视频| 天天操日日干夜夜撸| 一级片免费观看大全| 欧美日韩视频精品一区| 免费观看a级毛片全部| 国产成人av教育| 少妇的丰满在线观看| 成人三级做爰电影| 久久久久久久久免费视频了| 超碰成人久久| 午夜视频精品福利| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成年人免费黄色播放视频| 51午夜福利影视在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美国产精品va在线观看不卡| 午夜两性在线视频| www.自偷自拍.com| 亚洲成人国产一区在线观看| 黄频高清免费视频| 日本av免费视频播放| 久久久精品94久久精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜91福利影院| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费少妇av软件| 黄色视频不卡| 一夜夜www| 久9热在线精品视频| 久久ye,这里只有精品| netflix在线观看网站| 9色porny在线观看| 一本久久精品| 久久青草综合色| 曰老女人黄片| 999久久久国产精品视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 老司机午夜十八禁免费视频| av一本久久久久| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品国产区一区二| 免费少妇av软件| 免费高清在线观看日韩| 十八禁人妻一区二区| 最新在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久99一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| svipshipincom国产片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久久久久久国产电影| 深夜精品福利| 国产成人影院久久av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美国产精品va在线观看不卡| tube8黄色片| 一级片免费观看大全| 女警被强在线播放| 久久中文看片网| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲av国产av综合av卡| 国产av国产精品国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 高清av免费在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费日韩欧美在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 十八禁人妻一区二区| 午夜免费鲁丝| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 又黄又粗又硬又大视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 看免费av毛片| 日韩免费高清中文字幕av| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲av电影在线进入| 成年人黄色毛片网站| 午夜成年电影在线免费观看| 精品国产国语对白av| 午夜视频精品福利| 他把我摸到了高潮在线观看 | 伦理电影免费视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黄色 视频免费看| 成年动漫av网址| 99精品欧美一区二区三区四区| 91国产中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 视频在线观看一区二区三区| 午夜成年电影在线免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 两个人免费观看高清视频| 欧美在线一区亚洲| 青草久久国产| 国产日韩欧美在线精品| 视频区图区小说| 我要看黄色一级片免费的| 我的亚洲天堂| 亚洲欧美一区二区三区久久| 在线播放国产精品三级| 天天操日日干夜夜撸| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲综合色网址| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一区福利在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| e午夜精品久久久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人欧美在线观看 | 午夜日韩欧美国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 高清视频免费观看一区二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 中文字幕高清在线视频| 乱人伦中国视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产97色在线日韩免费| 不卡av一区二区三区| 免费少妇av软件| 国产福利在线免费观看视频| 成人三级做爰电影| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久中文字幕一级| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产亚洲精品久久久久5区| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜福利影视在线免费观看| tube8黄色片| 午夜福利在线观看吧| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产区一区二久久| www日本在线高清视频| avwww免费| 高清毛片免费观看视频网站 | 天天影视国产精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久精品国产a三级三级三级| 五月开心婷婷网| 国产麻豆69| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久国产精品麻豆| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色视频在线播放观看不卡| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产免费视频播放在线视频| 好男人电影高清在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 少妇的丰满在线观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产在线精品亚洲第一网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产成人精品在线电影| 桃花免费在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日本av免费视频播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 黄色 视频免费看| 91成年电影在线观看| e午夜精品久久久久久久| 精品久久久精品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一级毛片女人18水好多| 少妇 在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产1区2区3区精品| 美女午夜性视频免费| 桃红色精品国产亚洲av| 黄色毛片三级朝国网站| 99re在线观看精品视频| 久久性视频一级片| av国产精品久久久久影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av网站免费在线观看视频| av天堂久久9| 欧美 日韩 精品 国产| 中文字幕人妻丝袜制服| 多毛熟女@视频| 不卡一级毛片| videosex国产| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 国产精品久久久av美女十八| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 人人澡人人妻人| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久99一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久久国产精品麻豆| 午夜激情久久久久久久| 少妇 在线观看| 国产精品.久久久| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 高清视频免费观看一区二区| bbb黄色大片| 精品久久久精品久久久| 考比视频在线观看| 久久香蕉激情| 成人永久免费在线观看视频 | 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久久久成人av| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲免费av在线视频| 午夜激情av网站| 成年人免费黄色播放视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 岛国在线观看网站| 亚洲男人天堂网一区| 99热国产这里只有精品6| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美日韩精品网址| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一区在线观看完整版| 一本久久精品| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av又大| 黑人操中国人逼视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩精品网址| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人啪精品午夜网站| 蜜桃国产av成人99| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 最新美女视频免费是黄的| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 母亲3免费完整高清在线观看| 咕卡用的链子| 亚洲第一青青草原| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲成人手机| 国产不卡av网站在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 搡老岳熟女国产| 黑丝袜美女国产一区| 日本wwww免费看| 麻豆成人av在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 一区二区三区激情视频| 国产有黄有色有爽视频| 在线播放国产精品三级| 午夜免费成人在线视频| a级毛片在线看网站| 日日夜夜操网爽| 嫩草影视91久久| 久久精品成人免费网站| 黑人操中国人逼视频| 精品人妻在线不人妻| 日本一区二区免费在线视频| 黄色成人免费大全| 91成年电影在线观看| 久久久国产一区二区| 丝袜在线中文字幕| 精品福利永久在线观看| 午夜免费鲁丝| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 老司机福利观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲 国产 在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热99国产精品久久久久久7| 五月开心婷婷网| 国产一区二区 视频在线| 精品亚洲成国产av| 一二三四社区在线视频社区8| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99久久人妻综合| 日本av免费视频播放| 黄色视频在线播放观看不卡| 天天添夜夜摸| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 欧美中文综合在线视频| 日本五十路高清| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲七黄色美女视频| 成人精品一区二区免费| 人妻一区二区av| 搡老乐熟女国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产精品影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国内亚洲2022精品成人 | 成年人午夜在线观看视频| 黄色视频,在线免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久久久久久久久久久大奶| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品.久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲视频免费观看视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 男女午夜视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品成人免费网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 51午夜福利影视在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一级毛片女人18水好多| 黄片小视频在线播放| 国产片内射在线| 两个人免费观看高清视频| 婷婷丁香在线五月| 在线观看一区二区三区激情| 操出白浆在线播放| 悠悠久久av| 成人黄色视频免费在线看| 另类精品久久| 大香蕉久久成人网| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品二区激情视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久狼人影院| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 免费看十八禁软件| 欧美激情久久久久久爽电影 | 在线观看免费午夜福利视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人精品久久二区二区91| 91九色精品人成在线观看| 大香蕉久久网| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产高清videossex| 久久亚洲精品不卡| 国产成人啪精品午夜网站| 啦啦啦免费观看视频1| 一级片'在线观看视频| 精品人妻1区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丝瓜视频免费看黄片| tocl精华| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久9热在线精品视频| 老汉色∧v一级毛片| 波多野结衣一区麻豆| 蜜桃国产av成人99| 一区在线观看完整版| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 999久久久精品免费观看国产| 超色免费av| 午夜两性在线视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜福利在线观看吧| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产精品国产高清国产av | 1024视频免费在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久亚洲真实| 久久国产精品影院| 18在线观看网站| 国产日韩欧美视频二区| a在线观看视频网站| 亚洲三区欧美一区| 桃红色精品国产亚洲av| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产国语露脸激情在线看| 悠悠久久av| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲国产av新网站| 精品亚洲成国产av| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品高潮呻吟av久久| av网站在线播放免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产激情久久老熟女| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美精品av麻豆av| 1024香蕉在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| av有码第一页| 丝袜美足系列| 免费观看人在逋| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜制服| 成年人午夜在线观看视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲三区欧美一区| 99精品久久久久人妻精品| av天堂在线播放| 久久久久视频综合| 久久久精品免费免费高清| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲久久久国产精品| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲九九香蕉| 免费日韩欧美在线观看| 麻豆av在线久日| 欧美 日韩 精品 国产| 日本wwww免费看| 一个人免费看片子| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 91精品三级在线观看| 丝袜美足系列| 18禁美女被吸乳视频| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人影院久久av| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 色综合欧美亚洲国产小说| 考比视频在线观看| 天堂8中文在线网| 性高湖久久久久久久久免费观看|