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    一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離及其生物學特性

    2019-05-17 09:36:46徐敬昭陳貝杜秉海趙東英汪城墻丁延芹
    生物技術(shù)通報 2019年3期
    關鍵詞:鐵載體浸出液單胞菌

    徐敬昭 陳貝 杜秉海 趙東英 汪城墻 丁延芹

    (山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,泰安 271018)

    在土壤生態(tài)系統(tǒng)中,大部分細菌雖然存在而且有明顯的生物學活性,但難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離,不同的微生物學家使用很多術(shù)語來描述這些細菌,包括“寡營養(yǎng)細菌”[1]和“活的不可培養(yǎng)(Viable but non-culturable,VBNC)細菌”[2]等。寡營養(yǎng)細菌數(shù)量巨大、種類繁多、基因資源豐富,因此開發(fā)此類微生物已成為國內(nèi)外研究熱點。現(xiàn)階段的研究策略主要分為兩大類:一方面不斷改進現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)技術(shù);另一方面結(jié)合生物化學和分子生物學的原理建立與發(fā)展非培養(yǎng)方法,如磷酸脂肪酸(Phosphohpids fattyacid,PLFA)分析、Biology微孔板法及宏基因組測序等[3]。

    雖然以組學為代表的非培養(yǎng)方法推動了微生物資源的挖掘與利用,但這類方法也存在一些問題:首先,很難在細胞水平上對微生物進行實驗研究,無法深入了解微生物細胞的生命活動規(guī)律;其次,很難科學地描述和驗證微生物群落中不同種群之間的相互作用關系。因此,在利用非培養(yǎng)方法研究微生物多樣性的同時,有必要不斷優(yōu)化現(xiàn)有微生物培養(yǎng)技術(shù),二者結(jié)合以幫助我們深入研究微生物生命活動規(guī)律并探索其重要的生物學功能,在真正意義上實現(xiàn)微生物資源的開發(fā)與利用。

    寡營養(yǎng)細菌難以分離的原因及應對策略:(1)少數(shù)易培養(yǎng)微生物的競爭性干擾。根據(jù)MacArthur提出的 “R-K選擇”理論,易培養(yǎng)細菌是環(huán)境中的“R 選擇”者,能在短時間內(nèi)迅速倍增。而寡營養(yǎng)細菌作為環(huán)境中占多數(shù)的“K 選擇”者,能對有限資源進行最有效地利用,保持極低的生長率,以適應生境中的低營養(yǎng)條件。利用傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基可對易培養(yǎng)細菌進行有效富集,然而其生長必然伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗以及有害代謝產(chǎn)物的積累,進而抑制多數(shù)寡營養(yǎng)細菌的生長,使得最終分離的不一定是生境中密度最高或發(fā)揮主要功能的細菌。Button等[4]使用稀釋培養(yǎng)法,即當把樣品中的微生物群體稀釋至痕量時,樣品中的“K 選擇”者可以不受“R 選擇”者的干擾,大大提高寡營養(yǎng)細菌被分離的可能性。(2)傳統(tǒng)培養(yǎng)基無法提供不同種類微生物生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)。自然界中微生物種類豐富,不同種類的微生物生長代謝類型不同,對反應的底物要求也存在差異。傳統(tǒng)培養(yǎng)基大大簡化了營養(yǎng)組成,無法提供不同微生物生長繁殖所必需的某些化學物質(zhì)。為彌補這一缺陷,通常將土壤浸出液添加到合成培養(yǎng)基中,但添加比例通常為1∶100-1 000[5-6],這在很大程度上稀釋了其中所含生長因子的有效濃度。(3)傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分相對豐富或氧化環(huán)境的壓力。1 g土壤中通常含有106-109個微生物細胞[7],分配到每一個微生物細胞,其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏,多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài),傳統(tǒng)分離方法通常將微生物迅速置于富營養(yǎng)狀態(tài),突然的營養(yǎng)變化凸顯了一些細菌固有的基因缺陷,甚至成為其生長的主要障礙。這其中就包括有毒物質(zhì)的形成,如半乳糖苷增多、氧代謝形成有毒產(chǎn)物或自由基積累過快不可逆轉(zhuǎn)的對部分細胞造成損傷。研究表明,丙酮酸鈉與過氧化氫酶能降解培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒性氧[8],對恢復微生物可培養(yǎng)性具有良好效果。

    植物根際往往存在一類被稱為植物根際促生菌[9](Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)的微生物,它們能通過固氮、溶磷、拮抗病原菌以及產(chǎn)生鐵載體、各類水解酶和植物激素等方式顯著促進植物生長[10]。寡營養(yǎng)細菌難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到,不僅僅是由于營養(yǎng)水平的限制,而是上述因素的綜合效應。因此,本研究基于稀釋培養(yǎng)法,直接使用土壤浸出液配制寡營養(yǎng)培養(yǎng)基,以更好地模擬土壤原生境的營養(yǎng)成分,同時輔以丙酮酸鈉和過氧化氫酶以降解毒性氧物質(zhì),來分離寡營養(yǎng)細菌,并通過測定其產(chǎn)生鐵載體能力以及降解蛋白質(zhì)能力探索菌株在農(nóng)業(yè)上的應用價值。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試植株選用黃瓜(Cucumis sativusL.)于山東農(nóng)業(yè)大學溫室培育,于2017年2月播種,4月定植,常規(guī)栽培管理,植株長勢良好,至8月采集根際土壤樣品。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)基 (1)土壤浸出液:土壤 50.00 g,去離子水 1 L,pH 自然,混勻后用四層紗布粗濾,4℃,10 000 r/min離心1 min,取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩#?)本實驗所設計4類培養(yǎng)基配方詳見表1,具體配制過程如下:1、2號培養(yǎng)基滅菌前成分相同,即只含土壤浸出液,因此將1×105Pa滅菌的土壤浸出液與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌的土壤浸出液等體積混合后,倒板;3號培養(yǎng)基滅菌前為使用土壤浸出液配制2% LB:胰蛋白胨 0.20 g,酵母提取物 0.10 g,NaCl 0.20 g,土壤浸出液 1 L,pH 自然,1×105Pa滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌土壤浸出液等體積混合,倒板;4號培養(yǎng)基滅菌前為使用去離子水配制1% LB:胰蛋白胨 0.10 g,酵母提取物0.05 g,NaCl 0.10 g,去離子水 1 L,pH 自然,1×105Pa滅菌20 min,倒板。(3)2.27 mol/L丙酮酸鈉溶液:丙酮酸鈉 0.25 g,去離子水 1 mL,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,吸取100 μL涂布于對應培養(yǎng)基平板上,使涂布平板最終含有0.125%的丙酮酸鈉。(4)1×107U/L過氧化氫酶溶液:過氧化氫酶 2.00 g,0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液 1 L,pH 7.0,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,吸取200 μL涂布于對應培養(yǎng)基平板上,使涂布平板最終含有2 000 U的過氧化氫酶。(5)CAS檢測培養(yǎng)基[11]。(6)干酪素培養(yǎng)基:干酪素 10.00 g,瓊脂15.00 g,去離子水 1 L,pH 7.4。(7)產(chǎn)蛋白酶細菌發(fā)酵培養(yǎng)基:干酪素 10.00 g,去離子水 1 L,pH 7.4。上述(5)-(7)培養(yǎng)基1×105Pa滅菌20 min。

    表1 培養(yǎng)基配方

    1.2.2 土壤樣品采集 2017年11月9日從山東農(nóng)業(yè)大學溫室(36°11'N,117°06'E)采集黃瓜的根際土壤樣品。經(jīng)多次預試驗后選稀釋度10-6-10-7的土壤懸液各取100 μL涂布于寡營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上,于37℃溫箱中培養(yǎng)。然后挑取不同形態(tài)的菌落,在平板上劃線分離單菌落并結(jié)合鏡檢至菌落形態(tài)單一為止,并對菌株進行編號,分別保藏于4℃和-20℃冰箱備用。

    1.2.3 菌株分離鑒定 菌落與細胞形態(tài)鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[12]。部分生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13],通過Biology微生物鑒定系統(tǒng)進行生長實驗與化學敏感實驗。利用基因組快速抽提試劑盒(生工SK8255)提取基因組,提取方法參照配套說明書。采用細菌16S rRNA 基因通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), 擴增片段長度約為1 500 bp;gyrB基因引物XgyrB1F(5'-ACGAGTACAACCCGGACAA-3') 和 XgyrB1R(5'-CCCATCARGGTGCTGAAGAT-3'),擴增片段長度約為700 bp。對提取的菌株基因組DNA進行PCR擴增,采用50 μL PCR擴增反應體系:模板1 μL,引 物(F)1 μL, 引 物(R)1 μL,5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL, 加 超 純水補足到 50 μL。反應程序為:95℃預變性2 min;95℃變性20 s;55℃退火20 s;72℃延伸1 min(gyrB30 s),30個循環(huán)后,72℃延伸5 min,PCR 擴增產(chǎn)物于4℃保存。對擴增后的產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?;蛐蛄杏缮虾I锕こ谭沼邢薰具M行測定,將所獲得序列利用BLAST比對分析,從NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中挑選相似性序列并得到序列號信息,運用MEGA7.0軟件生成N-J進化樹,分析同源性關系較近的菌株。

    1.2.4 菌株對植物促生功能的檢測 參照王君[14]的方法對菌株的蛋白酶和鐵載體產(chǎn)生能力進行測定,蛋白酶活性測定參照《微生物學實驗》[15]。其中,試驗所采用陰性對照為鏈狀副球菌(Paracoccus alkenifer),是本實驗室保存的一株無蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力的細菌。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株鑒定結(jié)果

    2.1.1 分離菌株的形態(tài)觀察結(jié)果 培養(yǎng)7 d后,本研究所設計的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為:1號培養(yǎng)基32個,2號培養(yǎng)基23個,3號培養(yǎng)基40個,4號培養(yǎng)基8個。根據(jù)菌落形態(tài)差異,從上述培養(yǎng)基上挑取菌落數(shù)較多、生長速度較慢得1類菌,用三區(qū)劃線法進行純化,將其命名為S35。通過細胞形態(tài)觀察及革蘭氏染色進行初步鑒定,S35為G-菌、無內(nèi)生孢子、短桿狀、菌落較小微凸呈黃色、表面光滑濕潤不透明(圖1)。

    2.1.2 菌株S35生理生化鑒定結(jié)果 本研究共測定了菌株S35的77項生理生化特性(表2),其中脲酶陰性,氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、脂酶和精氨酸雙水解酶陽性,利用L-丙氨酸、L-組氨酸、L-乳酸及檸檬酸,能夠利用葡萄糖、麥芽糖和乳糖產(chǎn)酸,與模式株S. maltophilia的生理生化結(jié)果一致。

    圖1 菌株S35革蘭氏染色

    2.1.3 菌株S35基因序列分析結(jié)果 菌株S35經(jīng)PCR擴增的16S rRNA基因片段大小為1 438 bp,在GenBank中進行序列比對分析,與Stenotrophomonas maltophilia(登錄號:FJ906801.1)一致性為100%;gyrB基因片段大小為695 bp,與S. maltophilia(登錄號:EU499066.1)一致性為100%。使用MEGA 7.0軟件通過N-J法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),S35菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌均處同一支,遺傳進化距離最近。

    其中,gyrB的基因序列為:GAATCATCATCAT GACCGACGCCGACGTCGACGGCGCCCACATCCGCA CCCTGCTGCTGACGTTCTTCTACCGTCAGATGCCGG AGCTGATCGAGCGCGGTTACGTCTACATCGGCCTG CCGCCGCTGTACAAGATCAAGCAGGGCAAGCAGGAGCTGTACCTGAAGGACGACCCGGCGCTGGACAGC TACCTGGCCAGCAGCGCAGTGGAAAACGCTGCACT GGTGCCGGCCACCGGCGAGCCCGGCATCGAAGGCC TTGCGCTGGAGAAGCTGCTGCTGGCCTACGCGGCC GCGCTGGATTCGATCGAGCGCAACGCACATCGCTAC GACCGCAACCTGCTTGAAGCGCTGGTCGATTTCGTA CCGATGGACCTGCTGCCGGTGAAGGCGAGGGCCTG GATGCACTGGCCAAGCGCCTCAACCAGGCCGCGCTT GCAGGAAGCCAACGACGAGCGCCCGGCCGCTGTGC TGGTGACCCGTCGCCACATGGGTGAACAGCACATCC AGGTGCTGCCGATGTCGGCCTTCGAAAGCGGCGAA CTGCGCGCAATCCACCAGGCATCGAAGCTGCTGCAC GGTCTGGTGCGACCATTTCCCGCGGTGCCAAGTCGA TCGAAGTCGACAGCTTTGCCAAGGCACAGAACTGG CTGCTCGAGGAGGCCAAGCGCGGCCGCCAGATCCA GCGATTCAAGG。

    表2 菌株S35生理生化實驗結(jié)果

    2.2 菌株S35蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力檢測結(jié)果

    將菌株S35接種到干酪素檢測培養(yǎng)基和通用CAS檢測培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)72 h后菌株周圍均出現(xiàn)明顯水解圈和顯色圈,根據(jù)其直徑大小可以判定S35產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力大小(圖3和表3),說明菌株S35具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。經(jīng)干酪素發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后菌株S35在40℃,pH 11的條件下測定的蛋白酶活力為36 U/mL。

    圖2 基于16S rRNA(A)和gyrB(B)基因序列構(gòu)建菌株S35系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

    表3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

    3 討論

    一般認為,自然環(huán)境中微生物數(shù)量龐大,其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏,多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài),且一些微生物適宜生長在與自然環(huán)境相近的基質(zhì)中[16]。因此,采用低營養(yǎng)或輔以含少量生長因子的土壤浸出液制成的培養(yǎng)基會獲得較好的培養(yǎng)效果[17]。通過比較本研究所設計的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù),可以看出丙酮酸鈉、過氧化氫酶以及土壤浸出液的使用確實可增加寡營養(yǎng)培養(yǎng)基上可培養(yǎng)的菌落數(shù),進一步證實上述推論。當然,我們應充分重視自然生境中微生物的分布可能是隨營養(yǎng)漸變而呈現(xiàn)梯度分布,所以培養(yǎng)策略不應是全營養(yǎng)或100%稀釋后的簡單選擇,后續(xù)研究應使用不同營養(yǎng)梯度來深入分析營養(yǎng)濃度對菌株分離的影響。

    研究表明[18-19],使用常見細菌培養(yǎng)基很難分離得到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。本研究發(fā)現(xiàn),嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在100% LB培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時,生長速度快、菌落較大且飽滿,推測其在通常情況下不易分離得到的原因是在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上受具有生長優(yōu)勢的細菌的干擾。因此,實驗采用稀釋培養(yǎng)法同時配合低營養(yǎng)物質(zhì)濃度確實可以分離獲得在傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基上不易分離的細菌。其中,土壤浸出液的使用最大限度模擬土壤原生境,因此更加有利于植物根際環(huán)境中優(yōu)勢菌的生長。

    本研究利用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基從黃瓜根際土壤中分離得到S. maltophiliaS35。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌,屬于黃單胞菌目黃單胞菌科。該菌于1958年首次分離發(fā)現(xiàn),1993年有學者根據(jù)其無黃單胞菌素,無植物病原性,且能在37℃生長等特性提議將此菌命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。2017年,Singh等[20]首次報道S. maltophiliaSBP-9具有ACC脫氨酶活性并在鹽脅迫下可賦予小麥全植株的耐受性,增強小麥對生物和非生物脅迫的抗性。因此,接下來我們將進一步探索此菌在植物根際促生方面的應用潛力。

    4 結(jié)論

    本研究利用土壤浸出液為基礎培養(yǎng)基,適當添加能夠降低活性氧的成分來分離土壤中寡營養(yǎng)微生物是一類行之有效的方法。利用上述方法從黃瓜根際土壤分離得到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌,該菌株具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。

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