龍腦樟樹葉內(nèi)生真菌的分離及生物活性菌株的篩選鑒定

金宏杰 曹紅 劉紅 鄭爽 姜超

（1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000；2. 嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，嘉興 314000）

龍腦樟樹是重要的藥用樟，其枝葉精油富含右旋龍腦，因此是提取天然冰片的主要來源［1］。從藥用植物中尋找天然產(chǎn)物由來已久，但由于其產(chǎn)率低且對生態(tài)環(huán)境的破壞較大，迫切需要從新的來源尋找具有生物活性的天然產(chǎn)物［2］。因為藥用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物含有與宿主植物相同或相似的活性成分［3］，目前關(guān)于內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的研究越來越受重視。

內(nèi)生真菌是長期寄生于植物組織而不產(chǎn)生明顯癥狀的真菌［4］，同時也是天然藥物篩選的巨大寶庫。早在1904年就開始了對內(nèi)生真菌的研究但是起初并不受重視，直到紫杉醇的發(fā)現(xiàn)才有所好轉(zhuǎn)，并且在近幾年來更是飛速發(fā)展［5］，越來越多的研究表明其活性產(chǎn)物具有抗癌、抑菌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎癥反應(yīng)等功效。Stierle等［6］從短葉紫衫的韌皮部中分離出一種新的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae可產(chǎn)生紫杉醇和紫衫烷類化合物；Rehman等［7］從青脆枝種子中分離得到粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）能夠產(chǎn)生抗癌藥物喜樹堿。Isaka等［8］從香蕉中分離得到內(nèi)生真菌Botryosphaeriasp.BBC 8200能產(chǎn)生香豆素類抗癌物對多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性。由此可見市面上很多的藥物成分都可以在內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)分離。

龍腦樟樹作為重要的藥用植物，目前國內(nèi)外關(guān)于它的研究主要集中在其產(chǎn)冰片和精油方面而很少關(guān)注于它的內(nèi)生菌方向。Kharwar［9］對樟樹的內(nèi)生菌分布和抑菌活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葉片的中脈是內(nèi)生菌最聚集的地方，同時對Phytophthora cryptogea等病原菌有較強(qiáng)的抑制作用；游玲［10］對78油樟的內(nèi)生菌發(fā)揮性成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其成分主要是C10-C28的烷烴類，其他還有醇類、酯類等物質(zhì)。本研究從龍腦樟樹葉中分離得到內(nèi)生真菌，并對其發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌、抗氧化、抗腫瘤活性進(jìn)行研究，希望從中篩選具有良好生物活性的菌株，并為下一步次生代謝產(chǎn)物的分離奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 新鮮龍腦樟樹（Cinnamomum camphora）葉片采集于嘉興神木龍香林業(yè)有限公司（E：120.6410°，N：30.7266°），選擇一年生的生長狀態(tài)良好且相似，沒有腐爛或者病斑的葉片約20片，放于密封袋中保存。

1.1.2 細(xì)菌菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）均保存于嘉興學(xué)院微生物學(xué)研究室。

1.1.3 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7保存于嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)研究室。

1.1.4 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl5 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。PDA培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。察氏培養(yǎng)基：NaNO33 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、K2PHO41 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

1.1.5 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基，上海浩然生物技術(shù)有限公司；MTT，DPPH，水楊酸，雙氧水，抗壞血酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；藥敏試紙，南京茂捷生物科技有限公司。恒溫震蕩搖床，上海智城儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad實驗有限公司；倒置顯微鏡，上海光密儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計，澳大利亞GBC公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 采用組織塊法［11］對龍腦樟樹葉片中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離。將新鮮葉片在自來水下沖2 h后晾干，剪取5 mm×5 mm的葉片樣本放入50 mL離心管中準(zhǔn)備表面消毒。75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，75%乙醇浸泡1 min，無菌水洗3-5次。葉片陰干后接種于含250 μg/mL氯霉素的PDA和察氏培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。取最后一次漂洗液涂布于培養(yǎng)基上作為漂洗對照，取已消毒的葉片與培養(yǎng)基接觸20 min后取出作為組織對照，空白培養(yǎng)基作為環(huán)境對照。待樣本周圍長出菌絲后，用平板劃線法接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基上于28℃進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至形成單一菌落。

1.2.2 抑菌活性檢測 將純化完畢的菌株在PDB培養(yǎng)基中28℃，150 r/min液體發(fā)酵培養(yǎng)7 d后取3 mL發(fā)酵液于離心管中12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm無菌過濾器后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取在NA培養(yǎng)基上正常生長的4種細(xì)菌，用接種環(huán)挑取適量菌體，接種于裝有10 mL無菌水的錐形瓶中，震蕩均勻，調(diào)整菌懸液的濃度，使其含有的菌體的量在1×105-106個/mL。

根據(jù)Stefanakis等［12］的方法用K-B紙片法測抑菌圈直徑并觀察抑菌圈的透明程度，以10 μg/片的氨芐西林藥敏紙片作為陽性對照，空白培養(yǎng)基作為陰性對照，每次實驗3次重復(fù)，篩選出具有良好抑菌作用的菌株進(jìn)行下一步實驗。

1.2.3 抗腫瘤活性檢測 菌株液體發(fā)酵方式同1.2.2。用MTT法［13］測定發(fā)酵液原液對MCF-7細(xì)胞株的抑制率，具體方法如下。取對數(shù)生長期的上述細(xì)胞用胰蛋白酶消化稀釋成5×104個/mL，以每孔200 μL加入96孔板中，周圍一圈加入PBS溶液防止蒸發(fā)。于37℃，5% CO2條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后以空白培養(yǎng)基為對照，每孔加入30 μL上述制備好的發(fā)酵液每個樣品5個復(fù)孔作為重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并于不同時間觀察、拍照記錄細(xì)胞生長及形態(tài)變化。最后發(fā)酵液處理48 h后加入20 μL MTT（5.0 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm測定吸光度值。

清除率（%）=（1-對照組/實驗組）×100%

1.2.4 抗氧化性檢測

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除實驗參照Concepcion等［14］的方法并略有改動。取上述制備好的發(fā)酵液2 mL加入80 μmol/L的DPPH溶液2 mL，搖勻后靜至反應(yīng)25 min，無水乙醇調(diào)零，在517 nm測其吸光度記為A1。用2 mL樣品液和2 mL乙醇混合測其吸光度為A2，以無水乙醇代替樣品液作為空白對照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作為陽性對照，同一樣品3次平行對照。

清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%

1.2.4.2 羥自由基清除能力測定 羥基自由基清除能力測定參照Smirnoff等［15］方法并略有改動。取1 mL上述制備好的發(fā)酵液依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L水楊酸及1 mL 8.8 mmol/L的H2O2開始反應(yīng)。37℃恒溫水浴20 min后，測定510 nm處吸光度為A1。用蒸餾水替代水楊酸測吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品液作為空白對照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作為陽性對照，同一樣品3次平行。

1.2.4.3 過氧化氫清除能力測定 過氧化氫清除能力測定參照Du等［16］報道的方法并略有改動。取4 mL上述發(fā)酵液，加入以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配置的1%過氧化氫溶液1.0 mL，反應(yīng)10 min后230 nm下測吸光度記為A1。用不加H2O2的反應(yīng)液調(diào)零，以培養(yǎng)基代替樣品液作為空白對照A0。用1 mg/mL的Vc溶液作為陽性對照，同一樣品3次平行。

清除率 %=（A0-A1）/A0×100%

1.2.5 菌株鑒定 對既具有抑菌活性又具有較強(qiáng)抗腫瘤、抗氧化活性的菌株進(jìn)行鑒定。將菌株用CTAB法提取DNA，用ITS序列通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）；ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［17］，PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向ITS序列測定。測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行Blast比對后用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，確定種屬關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 龍腦樟樹葉內(nèi)菌的分離

采用不同培養(yǎng)基共從一年生龍腦樟樹新鮮葉片中分離得到不同內(nèi)生真菌39株，其中PDA培養(yǎng)基中分離出27株，察氏培養(yǎng)基中分離出12株。

2.2 抑菌活性測定

采用K-B紙片法對39株內(nèi)生真菌的抑菌活性進(jìn)行測定，以對4種病原菌抑菌圈直徑均大于1 cm為篩選條件共篩選出7株具有廣譜抑菌活性的內(nèi)生菌，分別為ZS7、ZS13、ZS14、ZS17、ZS22、ZS23、ZS38。其中ZS7對大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)（抑菌圈直徑1.60 cm）；ZS14對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)（抑菌圈直徑為1.25 cm）；ZS22對銅綠假單胞菌抑菌作用最強(qiáng)（抑菌圈直徑1.30 cm）；ZS13對枯草芽孢桿菌抑菌作用最強(qiáng)（抑菌圈直徑為1.70 cm）（表 1）。

2.3 抗腫瘤活性測定

用7株篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株進(jìn)行抗腫瘤活性的雙重活性篩選結(jié)果（圖1）顯示，ZS13、ZS14、ZS38具有明顯的抗腫瘤作用，MCF-7細(xì)胞經(jīng)發(fā)酵液處理后形態(tài)發(fā)生明顯變化，對照組細(xì)胞正常生長，實驗組細(xì)胞有不同程度的裂解碎片聚集成團(tuán)，形態(tài)變圓皺縮出現(xiàn)大量死亡，MTT結(jié)果顯示ZS13、ZS14、ZS38對MCF-7細(xì)胞的抑制率分別為57.40%、73.00%、61.00%。

表1 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌圈直徑（cm）

2.4 抗氧化活性測定

用7株篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株進(jìn)行抗氧化活性的雙重篩選結(jié)果（圖2-A）顯示，不同菌株對DPPH自由基、OH自由基、H2O2均具有一定程度的清除能力。其中ZS14、ZS17對DPPH·清除作用較強(qiáng)（＞70%），ZS7、ZS13也顯現(xiàn)出一定的清除作用（30%＜清除率＜70%）而ZS22、ZS23、ZS38清除能力則較弱（＜30%）。

圖1 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對MCF-7的抑制率

對OH·的清除結(jié)果（圖2-B）顯示，ZS14、ZS38對OH·具有較強(qiáng)的清除能力（＞70%），ZS7、ZS13、ZS17、ZS22、ZS23也顯現(xiàn)出一定的清除作用（50%＜清除率＜70%）。

對H2O2清除作用結(jié)果（圖2-C）顯示，ZS7、ZS14、ZS17、ZS22、ZS38具有較強(qiáng)的清除能力（＞70%），ZS23也顯現(xiàn)出一定的清除作用（40%＜清除率＜70%），ZS13清除能力則較弱（＜40%）。

綜上所述，菌株ZS14既具有抑菌活性又具有較強(qiáng)抗氧化活性和抗腫瘤活性。

2.5 菌株鑒定

測序結(jié)果（圖3）表明菌株ZS14的ITS序列長度為603 bp，BLAST比對與MF45131.1菌株的基因序列相似性達(dá)到100%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌株ZS14與KT265344.1聚為同一支，均屬于腐皮殼屬，因此將ZS14命名為Diaporthalessp.ZS14。

3 討論

植物內(nèi)生真菌不僅種類繁多，其次生代謝產(chǎn)物的生理活性也是多種多樣。在藥用領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、環(huán)境領(lǐng)域等都擁有不可或缺的作用［18］。目前研究人員已經(jīng)從多種植物中分離出皰霉屬、散囊菌屬、刺盤孢屬、擬莖點霉屬等多種內(nèi)生真菌［19］。

圖2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性評價

龍腦樟樹作為一種重要的藥用植物，其提取物芳香油、樟腦及冰片［20］在農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥等方面都具有廣泛的應(yīng)用［21］，但受到土地、氣候及提取方式等條件的制約，價格一直居高不下。本研究對龍腦樟樹葉片中的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和研究，希望從中發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)生物活性的菌株，從而通過微生物培育的方式尋找替代品。從龍腦樟樹樹葉中共分離出內(nèi)生真菌39株，檢測39株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液原液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑制活性發(fā)現(xiàn)，其中的7株菌具有較強(qiáng)抑菌性且對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有活性。

對這7株菌株的生物活性進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ZS14對MCF-7細(xì)胞具有最好的抑制作用，其抑制率達(dá)到了73%，在其發(fā)酵原液處理48 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形和死亡。對ZS14的抗氧化研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵原液對DPPH·的清除率達(dá)到70.92%；對OH·的清除率達(dá)到78.83%；對H2O2清除率達(dá)到81.36%，可見ZS14同時具有較強(qiáng)的抗氧化活性。最后ZS14被鑒定為Diaporthalessp.。

Diaporthesp.屬于腐皮殼屬，廣泛存在于植物界中。王沫等［22］研究了廣藿香內(nèi)生真菌Diaporthesp. A616的細(xì)胞毒活性發(fā)現(xiàn)從從中分離出的（22E，24R）-ergosta-4，6，8，（14）-22-tetraen-3-one 和（22E，24R）-3β，5α-dihydroxy-6β-ergosta-7，22-diene 對 腫瘤細(xì)胞株SF-268，MCF-7，NCIH460和 HepG-2具有顯著的抑制活性。Sousa等［23］對巴拿馬的雜草中分離出的Diaporthesp. F2934次生代謝物研究發(fā)現(xiàn)其含有的肌肽A和C表現(xiàn)出抗各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌活性。Ding等［24］對喜樹的內(nèi)生菌進(jìn)行了分離，從中也發(fā)現(xiàn)了Diaporthesp.具有抑菌性。

以上研究表明腐皮殼屬菌株具有強(qiáng)抑菌、抗腫瘤、抗氧化活性的潛力。而從龍腦樟樹分離出來的內(nèi)生菌具有與宿主植物相似代謝產(chǎn)物的特性，所以Diaporthalessp. ZS14其活性次級代謝產(chǎn)物的分離將作為下一步研究的重點，可以將其作為一個藥物開發(fā)的潛在來源。

圖3 基于菌株ZS14的rDNA-ITS基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論

本實驗通過對龍腦樟樹葉中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并檢測了菌株的抑菌、抗腫瘤、抗氧化活性。從中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌Diaporthalessp.ZS14，其具有最強(qiáng)的生物活性，具有較大的研究價值。