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    產(chǎn)黃酮番木瓜內(nèi)生真菌的篩選和鑒定

    2019-05-17 09:36:46柯樹煒呂金慧陳萍張榮萍俞悅
    生物技術(shù)通報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:番木瓜黃酮類內(nèi)生

    柯樹煒 呂金慧 陳萍 張榮萍 俞悅

    (海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,???570228)

    植物內(nèi)生真菌是一類定殖于宿主植物體內(nèi)的特殊微生物類群。自1993年Stierle等[1]從紅豆杉中分離得到了一株產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌安德魯紫杉菌(Taxomyces andrena)后,關(guān)于利用植物內(nèi)生真菌來獲得天然活性物質(zhì)的研究就成為了近年來的熱點。研究表明植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中天然活性成分非常豐富,不僅能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì),還能夠通過自身的代謝體系產(chǎn)生新的活性成分,已知結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)新穎的化合物均有報道[2]。番木瓜是著名的熱帶、亞熱帶果樹之一。含有生物堿、萜類化合物、黃酮類化合物等多種生物活性成分,研究表明其具有良好的生物活性[3-4]。但國內(nèi)外對番木瓜內(nèi)生真菌的研究仍然較少,本次實驗從番木瓜植株的莖、葉、果等各部位分離內(nèi)生真菌。通過對其菌株的次生代謝產(chǎn)物成分進行初步分析,篩選其中具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的菌株,并通過觀察PDA平板上菌落和分生孢子的形態(tài)以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)序列分析等手段對菌種進行了鑒定。本研究將為開發(fā)植物內(nèi)生真菌這一微生物資源和利用發(fā)酵法生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品與試劑 番木瓜采樣地點位于海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科基地,隨機采集不同番木瓜植株的葉片、枝條、果實。甲醇、乙醇、NaClO、乙酸乙酯、NaOH、FeCl3、硼酸、Al(NO3)3、NaNO2等均為分析純級試劑。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于分離和純化,馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)用于菌株搖瓶發(fā)酵。

    1.2 方法

    1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 番木瓜植株各部位內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的植物內(nèi)生菌組織分離法[5]。略作修改后具體做法如下:將從番木瓜植株上采集帶回的無明顯病斑葉片、枝條、果實用流水沖洗。用無菌刀片將上述番木瓜植株樣品切分成適當(dāng)大小的組織塊,首先用75%乙醇處理組織塊75 s、之后用2.6% NaClO溶液浸泡處理組織塊150 s,最后用無菌水沖洗3-5次進行表面消毒。將處理好后的樣品用無菌刀片除去暴露在外界環(huán)境中的表皮部分,切成0.5 cm × 0.5 cm組織塊。移入PDA培養(yǎng)基(含氯霉素)進行培養(yǎng),每個培養(yǎng)皿中呈品字形放置3個組織塊。28℃培養(yǎng)5-7 d,觀察并記錄組織塊的出菌狀況,及時轉(zhuǎn)移并純化菌株。

    1.2.2 菌株發(fā)酵與供試樣品的制備 選取于PDA平板上長勢良好且單一的菌株,利用直徑大小約為6 mm的打孔器在平板上打孔,將3-5個菌餅接種于滅菌冷卻后的PDB肉湯中。500 mL錐形瓶中加入250 mL PDB肉湯,封口膜扎緊,在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置溫度28℃、轉(zhuǎn)速130 r/min搖瓶發(fā)酵10 d。菌株發(fā)酵10 d之后,真空抽濾,分別得發(fā)酵液和菌絲體兩部分。發(fā)酵液利用等體積乙酸乙酯萃取3次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃將萃取液回收濃縮至原體積的1/10。過濾所得菌絲體在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)55℃烘干后研磨成粉,菌絲體和乙酸乙酯質(zhì)量體積比(W/V)為1:20料液比萃取,超聲處理1 h,過濾除去不溶物,減壓回收濃縮。將上述發(fā)酵液和菌絲體兩部分的濃縮萃取液合并,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,即得菌株的次生代謝產(chǎn)物,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 樣品的顯色反應(yīng)檢測[6-7]硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)檢測:將樣品液定點滴加于濾紙上,稍干之后反復(fù)滴加3次,濃縮樣品。將10%Al(NO3)3(W/V)溶液和NaNO2(W/V)溶液1:1混合滴加于樣品位置。揮干后濾紙片立即于紫外燈下檢視,觀察是否有熒光斑點或熒光環(huán)出現(xiàn)。

    氫氧化鈉溶液反應(yīng)檢測:將1.0 mL樣品液置于試管中,加入4%(W/V)的NaOH溶液0.2 mL,觀察是否有黃色或黃褐色現(xiàn)象出現(xiàn)。

    乙酸鎂甲醇溶液反應(yīng)檢測:將 1.0 mL樣品液置于試管中,加入1%(W/V)的乙酸鎂甲醇溶液0.25 mL,觀察是否有黃色出現(xiàn)。

    三氯化鐵溶液檢測:1.0 mL樣品液置于試管中,加入0.25 mL質(zhì)量分數(shù)為1%(W/V)的FeCl3溶液,充分混合,觀察是否有墨綠色至紫黑色現(xiàn)象出現(xiàn)。

    硼酸反應(yīng):將1.0 mL樣品液置于試管中,加入2%(W/V)的硼酸溶液0.25 mL,觀察溶液是否有黃色出現(xiàn)。

    1.2.4 薄層色譜法(TLC)以氯仿∶甲醇∶甲酸=15∶5∶1(V/V)為展開劑,在距離硅膠板一端0.4 cm處用鉛筆劃線,作為點樣起始線的標記。用毛細管將顯色反應(yīng)篩選所得陽性樣品點于硅膠板展開,以0.5 mg/mL槲皮素標準品作為對照。當(dāng)溶劑前沿達到硅膠板另一端0.2-0.3 cm時取出。使用3%(W/V)AlCl3甲醇溶液作為顯色劑,硅膠板取出揮干后噴霧顯色,365 nm紫外燈檢查和記錄。

    1.2.5 紫外吸收光譜檢測 以甲醇溶液為空白對照,將次生代謝產(chǎn)物樣品用甲醇定容并稀釋至適宜濃度,在220-420 nm之間進行光譜掃描,尋找樣品溶液最大吸收峰所在波長。檢測其是否符合黃酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征[8]。

    1.2.6 總黃酮含量的測定[9]菌株次生代謝產(chǎn)物中總黃酮含量的測量參照硝酸鋁顯色法,具體做法如下:分別吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL蘆丁溶液1.0 mL至于10 mL試管中,加入5%NaNO2(W/V)溶液0.4 mL混勻,放置6 min;加入Al(NO3)3(W/V)溶液 0.4 mL,放置 6 min;加入 4%(W/V)NaOH溶液4.0 mL,充分混合后用甲醇定容至10 mL,靜置反應(yīng)15 min;在510 nm處測定吸光值并建立標準曲線。將發(fā)酵所得次生代謝產(chǎn)物配置為1 mg/mL的甲醇溶液作為供試樣品液。根據(jù)標準曲線計算樣品中總黃酮含量。

    1.2.7 菌株鑒定 通過菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析,對經(jīng)顯色反應(yīng)篩選、TLC分析和UV分析后初步確定產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌進行鑒定。內(nèi)生真菌菌株形態(tài)特征的觀察通過插片法[10]進行制片,并利用棉藍染色液進行染色,在Leica生物顯微鏡DM2000下放大400倍和1 000倍檢視菌株分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征。ITS序列分析利用試劑盒D2300提取菌株總DNA,并選用ITS1F正向(5'-CTTGGTCATTTAGAGAAGTAA-3')和 ITS4反向(5'-TCCTCCGCTTAGATATGC-3')作為擴增引物。

    PCR采用25.0 μL反應(yīng)體系,具體如下:2 ×PCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L 的正反引物各 1.0 μL,內(nèi)生真菌菌株模板 DNA 1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,55℃退火40 s,72℃延伸50 s,總計30個循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物送廣州華大基因服務(wù)有限公司進行測序。測序所得內(nèi)生真菌的ITS序列通過BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行相似性序列檢索比對,若序列相似性大于99%,可鑒定為相同種;介于95%-99%之間,可鑒定為相同屬;小于95%,可鑒定為相同科[11],以此獲得菌株分子鑒定結(jié)果。通過MEGA7.0軟件[12],以鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,其中bootstrap設(shè)置檢驗值≥50%,共1 000次重復(fù)。

    2 結(jié)果

    2.1 顯色反應(yīng)初篩選

    由于硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)是黃酮類物質(zhì)的特異顯色劑,可以使黃酮類物質(zhì)在紫外燈下顯熒光,而其他顯色劑可能因為陽性反應(yīng)顏色變化較弱或樣品本身顏色較深不易觀察,因此本次實驗中利用顯色反應(yīng)篩選產(chǎn)黃酮菌株的必要條件是硝酸鋁-亞硝酸鈉濾紙顯色反應(yīng)為陽性。經(jīng)過顯色反應(yīng)的初步分析,在分離所得的內(nèi)生真菌中,菌株編號為G41的樣品液對下表中所述5種顯色反應(yīng)均顯陽性。初步判斷菌株G41可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)(表1)。

    表1 顯色反應(yīng)結(jié)果

    2.2 薄層層析結(jié)果分析

    對初篩選得到的陽性菌株進行薄層層析,樣品在硅膠板上展開并顯色后。菌株G41的乙酸乙酯提取物顯示出與對照所用槲皮素具有相同Rf值的黃綠色熒光斑點。說明其菌株的次生代謝產(chǎn)物中含有與槲皮素相同或相似的黃酮類化合物。其他菌株的乙酸乙酯提取物在展開顯色后雖然同樣能呈現(xiàn)黃綠色熒光斑點,但是與本次實驗中所用對照遷移率不符,可能含有的是與槲皮素不同的其他黃酮類的物質(zhì)(圖 1)。

    圖1 內(nèi)生真菌G41薄層層析圖

    2.3 紫外光譜掃描結(jié)果分析

    根據(jù)220-420 nm之間紫外光譜掃描的圖譜顯示,菌株G41的乙酸乙酯提取物在波長220-420 nm間有2個較明顯的吸收峰,最大吸收峰分別在317 nm、254 nm處,這與黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在200-400 nm間存在2個主要吸收峰帶分別是300-400 nm峰帶I和220-280峰帶II的UV光譜特征相符合(圖2)。進一步說明該菌株G41的乙酸乙酯提取物中存在黃酮類成分。

    圖2 菌株G41乙酸乙酯提取物在220-420 nm處的紫外光譜圖

    2.4 總黃酮含量測定結(jié)果

    如圖3所示,以蘆丁為對照品所測回歸方程為y= 1.045 7x+ 0.004 6,R2= 0.997 6,回歸方程表明其在0.1-1.0 mg之間的線性關(guān)系良好,經(jīng)換算被測樣品菌株G41濃度為1 mg/mL的乙酸乙酯提取物中總黃酮類物質(zhì)含量為0.187 8 mg/mL。

    圖3 總黃酮標準曲線圖

    2.5 菌株G41的形態(tài)與分子鑒定

    番木瓜內(nèi)生真菌G41在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d后,平板劃線處分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生,菌落正面呈現(xiàn)綠色或近灰綠色。菌絲有隔,分生孢子梗各頂端的小梗以掃帚狀的形式分支,產(chǎn)生球形或橢圓形的大量分生孢子。根據(jù)真菌鑒定手冊[13]進行比對,該內(nèi)生真菌菌株G41符合其中關(guān)于青霉屬菌株的形態(tài)特征描述。

    該菌株測序所得ITS序列在NCBI上通過BLAST程序進行比對,下載其中相似度最高的菌株序列以及相關(guān)種屬菌株的ITS序列數(shù)據(jù)并保存,利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖4所示?;?4個菌株的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,菌株G41與Penicillium citrinumMG659617.1和P.citrinumMH483870.1兩株橘青霉菌株聚在同一個分支(圖5)。通過ITS序列分析結(jié)合菌落和分生孢子形態(tài)特征,初步鑒定該內(nèi)生真菌G41為青霉屬橘青霉P. citrinum。

    圖4 內(nèi)生真菌G41的平板菌落形態(tài)及其分生孢子形態(tài)(放

    3 討論

    圖5 基于 rDNA ITS 序列采用鄰接法構(gòu)建的番木瓜內(nèi)生真菌G41與相關(guān)種屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    近年來,針對植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究日益增多,特別是關(guān)于活性成分生產(chǎn)菌的篩選以及活性物質(zhì)的化學(xué)成分分析等方面[14]。其中,能夠產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌在多種不同宿主植物的內(nèi)生真菌中均有報道,并且發(fā)現(xiàn)該部分內(nèi)生真菌多分布于鐮胞霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillin)、交鏈孢屬(Alternaria)等多個種屬中[15-16]。周寧等[17]從甘蔗葉內(nèi)生真菌中利用化學(xué)顯色反應(yīng)、薄層層析法和紫外吸收光譜法篩選出3株鑒定為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)和黑曲霉(Aspergillus niger)的產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌。范瑛閣等[18]利用化學(xué)顯色法和薄層層析法從羅布麻葉中篩選出可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的鐮孢菌(Fusariumsp.)和嗜松青霉(Penicillin pinophilum)。張海龍等[19]利用黃酮類物質(zhì)顯色反應(yīng)、薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)從銀杏根部位篩選出卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)2株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

    本研究選擇番木瓜為寄主植物作為試驗材料,篩選獲得1株產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌并鑒定為橘青霉,與在其他寄主植物上已發(fā)現(xiàn)的具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的內(nèi)生真菌有所不同。其所產(chǎn)黃酮類物質(zhì)與番木瓜是否具有內(nèi)在聯(lián)系有待進一步探究。本研究還發(fā)現(xiàn)了番木瓜其他內(nèi)生真菌對其中一種或數(shù)種顯色測試也有微弱的陽性反應(yīng)結(jié)果,有可能是其內(nèi)生真菌菌株液體發(fā)酵后,得到的黃酮類物質(zhì)產(chǎn)量較低或次生代謝產(chǎn)物中成分復(fù)雜從而影響了顯色結(jié)果,這也會導(dǎo)致部分產(chǎn)黃酮菌株漏篩。因此下一步研究需要通過高效液相色譜法、毛細管電泳法等更多檢測手段鑒別內(nèi)生真菌中次生代謝產(chǎn)物的成分[20],并通過微生物誘變育種[21]、培養(yǎng)基配方改良、發(fā)酵條件優(yōu)化[22]等手段,提高內(nèi)生真菌在宿主植物體外培養(yǎng)時產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的能力和穩(wěn)定性。

    4 結(jié)論

    本研究利用顯色反應(yīng)、TLC和UV法對番木瓜內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中是否含有黃酮類物質(zhì)進行了鑒別,篩選得到了1株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)成分的內(nèi)生真菌。并通過硝酸鋁顯色法測定了其菌絲體和發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中的總黃酮含量為0.187 8 mg/mL,表明其具有進一步開發(fā)利用的潛在價值。同時提取了該內(nèi)生真菌總DNA,利用擴增的ITS序列進行菌株的分子鑒定,并結(jié)合PDA平板上的菌落形態(tài)特征和顯微鏡下產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),鑒定該內(nèi)生真菌菌株G41為橘青霉(P. citrinum)。本研究擴展了篩選產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的寄主植物范圍,為利用番木瓜內(nèi)生真菌開發(fā)黃酮類活性成分提供了新的資源。

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