• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    產(chǎn)黃酮番木瓜內(nèi)生真菌的篩選和鑒定

    2019-05-17 09:36:46柯樹煒呂金慧陳萍張榮萍俞悅
    生物技術(shù)通報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:番木瓜黃酮類內(nèi)生

    柯樹煒 呂金慧 陳萍 張榮萍 俞悅

    (海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,???570228)

    植物內(nèi)生真菌是一類定殖于宿主植物體內(nèi)的特殊微生物類群。自1993年Stierle等[1]從紅豆杉中分離得到了一株產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌安德魯紫杉菌(Taxomyces andrena)后,關(guān)于利用植物內(nèi)生真菌來獲得天然活性物質(zhì)的研究就成為了近年來的熱點。研究表明植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中天然活性成分非常豐富,不僅能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì),還能夠通過自身的代謝體系產(chǎn)生新的活性成分,已知結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)新穎的化合物均有報道[2]。番木瓜是著名的熱帶、亞熱帶果樹之一。含有生物堿、萜類化合物、黃酮類化合物等多種生物活性成分,研究表明其具有良好的生物活性[3-4]。但國內(nèi)外對番木瓜內(nèi)生真菌的研究仍然較少,本次實驗從番木瓜植株的莖、葉、果等各部位分離內(nèi)生真菌。通過對其菌株的次生代謝產(chǎn)物成分進行初步分析,篩選其中具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的菌株,并通過觀察PDA平板上菌落和分生孢子的形態(tài)以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)序列分析等手段對菌種進行了鑒定。本研究將為開發(fā)植物內(nèi)生真菌這一微生物資源和利用發(fā)酵法生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品與試劑 番木瓜采樣地點位于海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科基地,隨機采集不同番木瓜植株的葉片、枝條、果實。甲醇、乙醇、NaClO、乙酸乙酯、NaOH、FeCl3、硼酸、Al(NO3)3、NaNO2等均為分析純級試劑。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于分離和純化,馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)用于菌株搖瓶發(fā)酵。

    1.2 方法

    1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 番木瓜植株各部位內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的植物內(nèi)生菌組織分離法[5]。略作修改后具體做法如下:將從番木瓜植株上采集帶回的無明顯病斑葉片、枝條、果實用流水沖洗。用無菌刀片將上述番木瓜植株樣品切分成適當(dāng)大小的組織塊,首先用75%乙醇處理組織塊75 s、之后用2.6% NaClO溶液浸泡處理組織塊150 s,最后用無菌水沖洗3-5次進行表面消毒。將處理好后的樣品用無菌刀片除去暴露在外界環(huán)境中的表皮部分,切成0.5 cm × 0.5 cm組織塊。移入PDA培養(yǎng)基(含氯霉素)進行培養(yǎng),每個培養(yǎng)皿中呈品字形放置3個組織塊。28℃培養(yǎng)5-7 d,觀察并記錄組織塊的出菌狀況,及時轉(zhuǎn)移并純化菌株。

    1.2.2 菌株發(fā)酵與供試樣品的制備 選取于PDA平板上長勢良好且單一的菌株,利用直徑大小約為6 mm的打孔器在平板上打孔,將3-5個菌餅接種于滅菌冷卻后的PDB肉湯中。500 mL錐形瓶中加入250 mL PDB肉湯,封口膜扎緊,在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置溫度28℃、轉(zhuǎn)速130 r/min搖瓶發(fā)酵10 d。菌株發(fā)酵10 d之后,真空抽濾,分別得發(fā)酵液和菌絲體兩部分。發(fā)酵液利用等體積乙酸乙酯萃取3次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃將萃取液回收濃縮至原體積的1/10。過濾所得菌絲體在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)55℃烘干后研磨成粉,菌絲體和乙酸乙酯質(zhì)量體積比(W/V)為1:20料液比萃取,超聲處理1 h,過濾除去不溶物,減壓回收濃縮。將上述發(fā)酵液和菌絲體兩部分的濃縮萃取液合并,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,即得菌株的次生代謝產(chǎn)物,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 樣品的顯色反應(yīng)檢測[6-7]硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)檢測:將樣品液定點滴加于濾紙上,稍干之后反復(fù)滴加3次,濃縮樣品。將10%Al(NO3)3(W/V)溶液和NaNO2(W/V)溶液1:1混合滴加于樣品位置。揮干后濾紙片立即于紫外燈下檢視,觀察是否有熒光斑點或熒光環(huán)出現(xiàn)。

    氫氧化鈉溶液反應(yīng)檢測:將1.0 mL樣品液置于試管中,加入4%(W/V)的NaOH溶液0.2 mL,觀察是否有黃色或黃褐色現(xiàn)象出現(xiàn)。

    乙酸鎂甲醇溶液反應(yīng)檢測:將 1.0 mL樣品液置于試管中,加入1%(W/V)的乙酸鎂甲醇溶液0.25 mL,觀察是否有黃色出現(xiàn)。

    三氯化鐵溶液檢測:1.0 mL樣品液置于試管中,加入0.25 mL質(zhì)量分數(shù)為1%(W/V)的FeCl3溶液,充分混合,觀察是否有墨綠色至紫黑色現(xiàn)象出現(xiàn)。

    硼酸反應(yīng):將1.0 mL樣品液置于試管中,加入2%(W/V)的硼酸溶液0.25 mL,觀察溶液是否有黃色出現(xiàn)。

    1.2.4 薄層色譜法(TLC)以氯仿∶甲醇∶甲酸=15∶5∶1(V/V)為展開劑,在距離硅膠板一端0.4 cm處用鉛筆劃線,作為點樣起始線的標記。用毛細管將顯色反應(yīng)篩選所得陽性樣品點于硅膠板展開,以0.5 mg/mL槲皮素標準品作為對照。當(dāng)溶劑前沿達到硅膠板另一端0.2-0.3 cm時取出。使用3%(W/V)AlCl3甲醇溶液作為顯色劑,硅膠板取出揮干后噴霧顯色,365 nm紫外燈檢查和記錄。

    1.2.5 紫外吸收光譜檢測 以甲醇溶液為空白對照,將次生代謝產(chǎn)物樣品用甲醇定容并稀釋至適宜濃度,在220-420 nm之間進行光譜掃描,尋找樣品溶液最大吸收峰所在波長。檢測其是否符合黃酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征[8]。

    1.2.6 總黃酮含量的測定[9]菌株次生代謝產(chǎn)物中總黃酮含量的測量參照硝酸鋁顯色法,具體做法如下:分別吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL蘆丁溶液1.0 mL至于10 mL試管中,加入5%NaNO2(W/V)溶液0.4 mL混勻,放置6 min;加入Al(NO3)3(W/V)溶液 0.4 mL,放置 6 min;加入 4%(W/V)NaOH溶液4.0 mL,充分混合后用甲醇定容至10 mL,靜置反應(yīng)15 min;在510 nm處測定吸光值并建立標準曲線。將發(fā)酵所得次生代謝產(chǎn)物配置為1 mg/mL的甲醇溶液作為供試樣品液。根據(jù)標準曲線計算樣品中總黃酮含量。

    1.2.7 菌株鑒定 通過菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析,對經(jīng)顯色反應(yīng)篩選、TLC分析和UV分析后初步確定產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌進行鑒定。內(nèi)生真菌菌株形態(tài)特征的觀察通過插片法[10]進行制片,并利用棉藍染色液進行染色,在Leica生物顯微鏡DM2000下放大400倍和1 000倍檢視菌株分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征。ITS序列分析利用試劑盒D2300提取菌株總DNA,并選用ITS1F正向(5'-CTTGGTCATTTAGAGAAGTAA-3')和 ITS4反向(5'-TCCTCCGCTTAGATATGC-3')作為擴增引物。

    PCR采用25.0 μL反應(yīng)體系,具體如下:2 ×PCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L 的正反引物各 1.0 μL,內(nèi)生真菌菌株模板 DNA 1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,55℃退火40 s,72℃延伸50 s,總計30個循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物送廣州華大基因服務(wù)有限公司進行測序。測序所得內(nèi)生真菌的ITS序列通過BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行相似性序列檢索比對,若序列相似性大于99%,可鑒定為相同種;介于95%-99%之間,可鑒定為相同屬;小于95%,可鑒定為相同科[11],以此獲得菌株分子鑒定結(jié)果。通過MEGA7.0軟件[12],以鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,其中bootstrap設(shè)置檢驗值≥50%,共1 000次重復(fù)。

    2 結(jié)果

    2.1 顯色反應(yīng)初篩選

    由于硝酸鋁-亞硝酸鈉反應(yīng)是黃酮類物質(zhì)的特異顯色劑,可以使黃酮類物質(zhì)在紫外燈下顯熒光,而其他顯色劑可能因為陽性反應(yīng)顏色變化較弱或樣品本身顏色較深不易觀察,因此本次實驗中利用顯色反應(yīng)篩選產(chǎn)黃酮菌株的必要條件是硝酸鋁-亞硝酸鈉濾紙顯色反應(yīng)為陽性。經(jīng)過顯色反應(yīng)的初步分析,在分離所得的內(nèi)生真菌中,菌株編號為G41的樣品液對下表中所述5種顯色反應(yīng)均顯陽性。初步判斷菌株G41可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)(表1)。

    表1 顯色反應(yīng)結(jié)果

    2.2 薄層層析結(jié)果分析

    對初篩選得到的陽性菌株進行薄層層析,樣品在硅膠板上展開并顯色后。菌株G41的乙酸乙酯提取物顯示出與對照所用槲皮素具有相同Rf值的黃綠色熒光斑點。說明其菌株的次生代謝產(chǎn)物中含有與槲皮素相同或相似的黃酮類化合物。其他菌株的乙酸乙酯提取物在展開顯色后雖然同樣能呈現(xiàn)黃綠色熒光斑點,但是與本次實驗中所用對照遷移率不符,可能含有的是與槲皮素不同的其他黃酮類的物質(zhì)(圖 1)。

    圖1 內(nèi)生真菌G41薄層層析圖

    2.3 紫外光譜掃描結(jié)果分析

    根據(jù)220-420 nm之間紫外光譜掃描的圖譜顯示,菌株G41的乙酸乙酯提取物在波長220-420 nm間有2個較明顯的吸收峰,最大吸收峰分別在317 nm、254 nm處,這與黃酮類化合物的甲醇溶液普遍在200-400 nm間存在2個主要吸收峰帶分別是300-400 nm峰帶I和220-280峰帶II的UV光譜特征相符合(圖2)。進一步說明該菌株G41的乙酸乙酯提取物中存在黃酮類成分。

    圖2 菌株G41乙酸乙酯提取物在220-420 nm處的紫外光譜圖

    2.4 總黃酮含量測定結(jié)果

    如圖3所示,以蘆丁為對照品所測回歸方程為y= 1.045 7x+ 0.004 6,R2= 0.997 6,回歸方程表明其在0.1-1.0 mg之間的線性關(guān)系良好,經(jīng)換算被測樣品菌株G41濃度為1 mg/mL的乙酸乙酯提取物中總黃酮類物質(zhì)含量為0.187 8 mg/mL。

    圖3 總黃酮標準曲線圖

    2.5 菌株G41的形態(tài)與分子鑒定

    番木瓜內(nèi)生真菌G41在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d后,平板劃線處分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生,菌落正面呈現(xiàn)綠色或近灰綠色。菌絲有隔,分生孢子梗各頂端的小梗以掃帚狀的形式分支,產(chǎn)生球形或橢圓形的大量分生孢子。根據(jù)真菌鑒定手冊[13]進行比對,該內(nèi)生真菌菌株G41符合其中關(guān)于青霉屬菌株的形態(tài)特征描述。

    該菌株測序所得ITS序列在NCBI上通過BLAST程序進行比對,下載其中相似度最高的菌株序列以及相關(guān)種屬菌株的ITS序列數(shù)據(jù)并保存,利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖4所示?;?4個菌株的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,菌株G41與Penicillium citrinumMG659617.1和P.citrinumMH483870.1兩株橘青霉菌株聚在同一個分支(圖5)。通過ITS序列分析結(jié)合菌落和分生孢子形態(tài)特征,初步鑒定該內(nèi)生真菌G41為青霉屬橘青霉P. citrinum。

    圖4 內(nèi)生真菌G41的平板菌落形態(tài)及其分生孢子形態(tài)(放

    3 討論

    圖5 基于 rDNA ITS 序列采用鄰接法構(gòu)建的番木瓜內(nèi)生真菌G41與相關(guān)種屬菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

    近年來,針對植物內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究日益增多,特別是關(guān)于活性成分生產(chǎn)菌的篩選以及活性物質(zhì)的化學(xué)成分分析等方面[14]。其中,能夠產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌在多種不同宿主植物的內(nèi)生真菌中均有報道,并且發(fā)現(xiàn)該部分內(nèi)生真菌多分布于鐮胞霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillin)、交鏈孢屬(Alternaria)等多個種屬中[15-16]。周寧等[17]從甘蔗葉內(nèi)生真菌中利用化學(xué)顯色反應(yīng)、薄層層析法和紫外吸收光譜法篩選出3株鑒定為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)和黑曲霉(Aspergillus niger)的產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌。范瑛閣等[18]利用化學(xué)顯色法和薄層層析法從羅布麻葉中篩選出可產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的鐮孢菌(Fusariumsp.)和嗜松青霉(Penicillin pinophilum)。張海龍等[19]利用黃酮類物質(zhì)顯色反應(yīng)、薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)從銀杏根部位篩選出卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)2株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

    本研究選擇番木瓜為寄主植物作為試驗材料,篩選獲得1株產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌并鑒定為橘青霉,與在其他寄主植物上已發(fā)現(xiàn)的具有產(chǎn)黃酮類物質(zhì)功能的內(nèi)生真菌有所不同。其所產(chǎn)黃酮類物質(zhì)與番木瓜是否具有內(nèi)在聯(lián)系有待進一步探究。本研究還發(fā)現(xiàn)了番木瓜其他內(nèi)生真菌對其中一種或數(shù)種顯色測試也有微弱的陽性反應(yīng)結(jié)果,有可能是其內(nèi)生真菌菌株液體發(fā)酵后,得到的黃酮類物質(zhì)產(chǎn)量較低或次生代謝產(chǎn)物中成分復(fù)雜從而影響了顯色結(jié)果,這也會導(dǎo)致部分產(chǎn)黃酮菌株漏篩。因此下一步研究需要通過高效液相色譜法、毛細管電泳法等更多檢測手段鑒別內(nèi)生真菌中次生代謝產(chǎn)物的成分[20],并通過微生物誘變育種[21]、培養(yǎng)基配方改良、發(fā)酵條件優(yōu)化[22]等手段,提高內(nèi)生真菌在宿主植物體外培養(yǎng)時產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的能力和穩(wěn)定性。

    4 結(jié)論

    本研究利用顯色反應(yīng)、TLC和UV法對番木瓜內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中是否含有黃酮類物質(zhì)進行了鑒別,篩選得到了1株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)成分的內(nèi)生真菌。并通過硝酸鋁顯色法測定了其菌絲體和發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中的總黃酮含量為0.187 8 mg/mL,表明其具有進一步開發(fā)利用的潛在價值。同時提取了該內(nèi)生真菌總DNA,利用擴增的ITS序列進行菌株的分子鑒定,并結(jié)合PDA平板上的菌落形態(tài)特征和顯微鏡下產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),鑒定該內(nèi)生真菌菌株G41為橘青霉(P. citrinum)。本研究擴展了篩選產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的寄主植物范圍,為利用番木瓜內(nèi)生真菌開發(fā)黃酮類活性成分提供了新的資源。

    猜你喜歡
    番木瓜黃酮類內(nèi)生
    墨西哥:全球最大番木瓜出口國
    MS-DAIL聯(lián)合MS-FINDER鑒定中藥黃酮類化合物
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動力
    HPLC法同時測定白梅花中6種黃酮類成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:46
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動力
    番木瓜豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)
    紅土地(2016年3期)2017-01-15 13:45:37
    印度的番木瓜產(chǎn)業(yè)增長
    墨西哥成為世界最大番木瓜出口國
    1000部很黄的大片| 男女下面进入的视频免费午夜| 五月伊人婷婷丁香| 欧美一区二区亚洲| 一本一本综合久久| 黄色欧美视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日日撸夜夜添| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲成人久久性| 免费av毛片视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲,欧美,日韩| 中文字幕av成人在线电影| 少妇人妻一区二区三区视频| 波多野结衣高清作品| 色播亚洲综合网| 麻豆av噜噜一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文在线观看免费www的网站| 成人美女网站在线观看视频| 白带黄色成豆腐渣| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 日韩欧美 国产精品| 我的女老师完整版在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产久久久一区二区三区| 特级一级黄色大片| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 老女人水多毛片| 网址你懂的国产日韩在线| 国产三级在线视频| 乱人视频在线观看| 日本黄色片子视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产三级中文精品| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 三级经典国产精品| 免费电影在线观看免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 可以在线观看毛片的网站| 精品一区二区三区人妻视频| 97在线视频观看| 国产精品一区www在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 一级av片app| 桃色一区二区三区在线观看| 成人二区视频| 日韩欧美国产在线观看| 成年av动漫网址| 级片在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久精品国产亚洲网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产探花在线观看一区二区| 色5月婷婷丁香| 在线观看66精品国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 草草在线视频免费看| 亚洲av一区综合| 干丝袜人妻中文字幕| 91狼人影院| 日韩一本色道免费dvd| 波多野结衣高清作品| 日韩亚洲欧美综合| 日韩在线高清观看一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 乱人视频在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久伊人网av| videossex国产| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲色图av天堂| 国内揄拍国产精品人妻在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 黄色配什么色好看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 六月丁香七月| 中文字幕久久专区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 搞女人的毛片| www.色视频.com| videossex国产| 老女人水多毛片| 国产成人精品久久久久久| 国产男人的电影天堂91| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久成人免费电影| 国产成人影院久久av| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| а√天堂www在线а√下载| 精品午夜福利视频在线观看一区| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久久久久大av| 国产亚洲精品久久久com| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产高清视频在线播放一区| 一级毛片久久久久久久久女| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 国产一区二区在线av高清观看| 国产美女午夜福利| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 成年av动漫网址| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人福利小说| 欧美成人免费av一区二区三区| 三级经典国产精品| 亚洲18禁久久av| 国产精品一区www在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 日本与韩国留学比较| 国产高清有码在线观看视频| 99热这里只有是精品50| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中国美女看黄片| 成人综合一区亚洲| 欧美日韩在线观看h| 亚洲av熟女| 亚洲国产精品国产精品| 在线观看av片永久免费下载| 久久6这里有精品| 直男gayav资源| 成年女人看的毛片在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| a级毛色黄片| 国产成人freesex在线 | av在线老鸭窝| 日韩人妻高清精品专区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 精品一区二区三区av网在线观看| 深夜a级毛片| 亚洲五月天丁香| 亚洲av成人精品一区久久| 中文字幕av成人在线电影| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产av一区在线观看免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲内射少妇av| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品1区2区在线观看.| 波多野结衣高清作品| 免费在线观看成人毛片| 欧美区成人在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产高清不卡午夜福利| 日韩强制内射视频| 国产在视频线在精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 无遮挡黄片免费观看| 六月丁香七月| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩三级伦理在线观看| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美区成人在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美成人免费av一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲性久久影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费高清视频大片| 亚洲最大成人手机在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美最新免费一区二区三区| 成人国产麻豆网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 晚上一个人看的免费电影| 日本熟妇午夜| 午夜福利18| 天美传媒精品一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩中字成人| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲国产精品成人综合色| 精品国内亚洲2022精品成人| av国产免费在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 18+在线观看网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av女优亚洲男人天堂| 黄色配什么色好看| 麻豆国产97在线/欧美| 99热这里只有是精品在线观看| 色综合色国产| 久久久精品欧美日韩精品| 天堂影院成人在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 全区人妻精品视频| 欧美性感艳星| 99久久精品一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| av女优亚洲男人天堂| 色综合色国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| av黄色大香蕉| 搡老岳熟女国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av美国av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产三级中文精品| 99久国产av精品国产电影| 少妇熟女aⅴ在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 老女人水多毛片| 国产 一区精品| 国产淫片久久久久久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 村上凉子中文字幕在线| 最近的中文字幕免费完整| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色哟哟·www| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人影院久久av| 亚洲性久久影院| 免费高清视频大片| 老女人水多毛片| av国产免费在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 在线播放无遮挡| 国产高清视频在线观看网站| 国产大屁股一区二区在线视频| 色在线成人网| 午夜激情欧美在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费观看精品视频网站| 国产私拍福利视频在线观看| 老司机福利观看| 97碰自拍视频| 国产美女午夜福利| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | av卡一久久| 成人欧美大片| 丰满的人妻完整版| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲电影在线观看av| 一夜夜www| 看片在线看免费视频| 丰满的人妻完整版| 人妻久久中文字幕网| 久久欧美精品欧美久久欧美| 人妻少妇偷人精品九色| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久久末码| 网址你懂的国产日韩在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一级毛片aaaaaa免费看小| www.色视频.com| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品人妻少妇| 欧美色视频一区免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 最近在线观看免费完整版| 久久亚洲国产成人精品v| 一级a爱片免费观看的视频| 99久久精品国产国产毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 18禁在线播放成人免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 观看免费一级毛片| 丰满的人妻完整版| 又爽又黄a免费视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 秋霞在线观看毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 成人性生交大片免费视频hd| 国内精品美女久久久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产免费男女视频| 日韩欧美免费精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩强制内射视频| 97超碰精品成人国产| 亚洲av成人av| 99精品在免费线老司机午夜| 久久人人爽人人爽人人片va| 99热这里只有是精品50| 国产精品人妻久久久影院| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 99热这里只有是精品在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 春色校园在线视频观看| 国产精品久久久久久久电影| 最近手机中文字幕大全| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 69人妻影院| 久久久久免费精品人妻一区二区| 乱人视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 男女边吃奶边做爰视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 联通29元200g的流量卡| 哪里可以看免费的av片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇熟女久久| 久久人人精品亚洲av| 国产老妇女一区| 免费人成视频x8x8入口观看| 综合色av麻豆| 免费高清视频大片| 久久99热这里只有精品18| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 日韩欧美三级三区| 在线免费观看的www视频| 国产成年人精品一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| avwww免费| 99久久中文字幕三级久久日本| 色哟哟·www| 我要看日韩黄色一级片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久久久久午夜电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩强制内射视频| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品精品国产色婷婷| 美女内射精品一级片tv| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产三级在线视频| 最新中文字幕久久久久| 综合色丁香网| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日本一本二区三区精品| 看十八女毛片水多多多| 婷婷精品国产亚洲av在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久久久九九精品影院| 亚洲久久久久久中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 日本a在线网址| 在线免费十八禁| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美激情国产日韩精品一区| av在线观看视频网站免费| 国产精品久久久久久精品电影| 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产精品国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 春色校园在线视频观看| 欧美丝袜亚洲另类| 天堂网av新在线| 国产视频一区二区在线看| 日韩中字成人| 国产精品女同一区二区软件| 国产人妻一区二区三区在| 联通29元200g的流量卡| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲自偷自拍三级| 99久久精品国产国产毛片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 搡老岳熟女国产| 69av精品久久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 成人综合一区亚洲| av.在线天堂| 亚洲内射少妇av| 久久午夜亚洲精品久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 免费观看在线日韩| 亚州av有码| 日韩高清综合在线| 国产91av在线免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 乱人视频在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 国产成人一区二区在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 如何舔出高潮| 国产毛片a区久久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 岛国在线免费视频观看| 女人被狂操c到高潮| 中国美白少妇内射xxxbb| 嫩草影视91久久| АⅤ资源中文在线天堂| 中国美女看黄片| 九九爱精品视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美日韩精品成人综合77777| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品伦人一区二区| 日本成人三级电影网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲成人久久爱视频| 国产久久久一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美性感艳星| 欧美成人免费av一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 色播亚洲综合网| 级片在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜福利在线观看吧| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 99视频精品全部免费 在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品久久久久久久久免| 特级一级黄色大片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 乱人视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区三区av在线 | 91av网一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 看片在线看免费视频| 亚洲av二区三区四区| 精品久久国产蜜桃| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 超碰av人人做人人爽久久| 成人欧美大片| 此物有八面人人有两片| АⅤ资源中文在线天堂| 给我免费播放毛片高清在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av天堂中文字幕网| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 综合色av麻豆| 久99久视频精品免费| 亚洲在线观看片| 午夜福利高清视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩大尺度精品在线看网址| av在线蜜桃| 五月玫瑰六月丁香| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久人妻av系列| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成人av一区二区三区在线看| 国产黄色小视频在线观看| 级片在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 色播亚洲综合网| 99久久精品一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 美女内射精品一级片tv| 尾随美女入室| 日日撸夜夜添| 亚洲精品国产av成人精品 | 亚洲美女视频黄频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| av专区在线播放| 久久久久久伊人网av| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品熟女少妇av免费看| 91久久精品国产一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 老熟妇仑乱视频hdxx| 偷拍熟女少妇极品色| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品一区二区三区人妻视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 麻豆一二三区av精品| 99热网站在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品456在线播放app| 免费在线观看影片大全网站| 久久6这里有精品| 中文字幕久久专区| 欧美日韩在线观看h| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 成人三级黄色视频| 一级毛片电影观看 | 两个人视频免费观看高清| 麻豆一二三区av精品| 日日撸夜夜添| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 草草在线视频免费看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产高清视频在线播放一区| 免费观看的影片在线观看| 国产免费男女视频| 国产黄a三级三级三级人| 中文在线观看免费www的网站| 久久久成人免费电影| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一a级毛片在线观看| 国产视频内射| 又粗又爽又猛毛片免费看| 精品欧美国产一区二区三| 黄色日韩在线| 偷拍熟女少妇极品色| 青春草视频在线免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 美女高潮的动态| 嫩草影视91久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av不卡在线观看| 日韩欧美精品v在线| 熟女人妻精品中文字幕| 熟女电影av网| 国产精品久久视频播放| 国产午夜精品论理片| 成人特级av手机在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国内精品美女久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 三级经典国产精品| 欧美zozozo另类| 久久久久久久久久成人| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲成av人片在线播放无| 成人特级av手机在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲精品456在线播放app| 国产乱人视频| 国产淫片久久久久久久久| 不卡一级毛片| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看免费视频日本深夜| 嫩草影院入口| .国产精品久久| 欧美zozozo另类| 黄色配什么色好看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 黄色视频,在线免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 97在线视频观看| 赤兔流量卡办理| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品一及| 国产精品久久电影中文字幕| 美女免费视频网站| 成人亚洲精品av一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 99热全是精品| 日本与韩国留学比较| 精品无人区乱码1区二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利高清视频|