花生根際多功能固氮菌的分離及其耐鹽堿特性研究

姜煥煥 祁佩時 王通 遲曉元 陳明娜

（1. 山東省花生研究所，青島 266100；2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150001）

土壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一。鹽堿土壤中無機鹽含量豐富，有機質(zhì)含量低，不適宜施用無機肥；而且由于鹽離子的存在，會限制植物對氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的吸收，這進一步造成鹽堿土壤中植物可利用營養(yǎng)元素的缺失［1］?；ㄉˋrachis hypogaeaL.）是重要的油料和經(jīng)濟作物，主要生長在干旱和半干旱地區(qū)［2］?；ㄉ鷮儆谥卸饶望}的植物，鹽分脅迫對花生生長發(fā)育的各個方面都會產(chǎn)生不利影響［3］。因而，提高鹽堿地花生營養(yǎng)元素的獲得，進而提高花生的耐鹽堿性，增加鹽堿地花生產(chǎn)量是很有必要的。

根際促生菌（PGPR）是一類生存于植物根際土壤，同時兼具固氮、溶磷和分泌生長素的能力，能夠提高植物抗逆性，促進植物生長的功能菌群［4］。此外，根際促生菌能夠作為微生物肥料，提高土壤肥力，改善土壤生態(tài)環(huán)境［5-6］。根際促生菌與植物根系的相互作用是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，受土壤類型和植物根系分泌物等多種因素影響［7］。Arora等［8］研究發(fā)現(xiàn)，分離自鹽堿土壤中的PGPR，具有較強的定值能力及鹽堿耐受性，能夠促進鹽堿環(huán)境條件下植物的生長。近年來，鹽堿地中多種植物根際促生菌的分離與應(yīng)用相繼被報道［9-10］。目前，不同土壤環(huán)境中的花生根際促生菌得到了分離。如姜瑛等［11］從灰潮土中的花生根際中鑒定出具有固氮解磷功能的促生菌。劉曄等［12］從砂質(zhì)潮土中的根際中篩選出具有固氮、解磷、解鉀的促生菌，并成功促進了花生在砂質(zhì)潮土中的生長。但是，關(guān)于鹽堿地花生根際多功能固氮菌鮮有報道。

鹽堿地的特殊理化性質(zhì)導(dǎo)致非土著功能菌的定值能力、鹽堿耐受能力及功能活性下降。因此分離自鹽堿地花生根際的促生菌能夠最大化發(fā)揮其促進鹽堿條件下花生的生長作用。本實驗首次選取黃河三角洲沿海地區(qū)花生根際土壤為研究對象，篩選鑒定出具有固氮、溶磷及分泌IAA能力的功能菌株，并對其鹽堿耐受性能進行了測定。該結(jié)果豐富了微生物肥料生產(chǎn)的菌種庫，對通過微生物改良鹽堿地，提高花生產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采自山東省東營市黃河三角洲區(qū)域的鹽堿地花生根際（北緯37°05'-37°40'，東經(jīng) 118°03'-118°38'），定 10 個取樣點，每個取樣點間隔1 m，刮去土壤表層的根茬殘體等，用滅菌土鉆采集0-20 cm 的土樣，混勻，放入無菌密封袋內(nèi)，帶回實驗室后4℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 阿須貝固氮菌培養(yǎng)基（Ashby）：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，甘露醇 10 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.0-7.5。

無機磷培養(yǎng)基（TPM）：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.0 g，定容至 1 000 mL，pH 值 7.0-7.5。分別以FePO4和ALPO3代替Ca3（PO4）2不溶性P源。

有機磷培養(yǎng)基（YM）：以0.5 g的卵磷脂代替無機磷培養(yǎng)基中的Ca3（PO4）2。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）：牛肉膏10 g，蛋白 胨 10 g，NaCl 5 g， 定 容 至 1 000 mL，pH 值7.0-7.5。

無 氮 培 養(yǎng) 基： 蔗 糖 10 g，NaCl 0.12 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，CaCO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0-7.2。

DF培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸鈉 2.0 g， 檸 檬 酸 2.0 g，KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO42.0 g，組分一、組分二溶液各0.1 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0-7.2；其中組分一：H3BO310 mg，MnSO4·H2O 11.19 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，10 mg，滅菌蒸餾水 100 mL；組分二：FeSO4·7H2O 100 mg 溶于10 mL滅菌蒸餾水中。

ADF培養(yǎng)基：ACC溶于滅菌蒸餾水，0.22 um濾膜過濾除菌，然后加到不含（NH4）2SO4的DF培養(yǎng)基內(nèi)，使其終濃度為3.0 mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 采用Ashby培養(yǎng)基進行固氮菌的分離，稱取5 g土樣，加入裝有45 mL的無菌水的三角瓶中震蕩30 min，取1 mL上清液，加入到裝有9 mL無菌水的試管中，逐級稀釋至10-6濃度。取10-3-10-5的濃度梯度0.1 mL涂布于Ashby平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d直至出現(xiàn)單菌落，然后進行分離純化，直至得到純菌落。將所得純菌落接種于LB斜面培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rDNA 的擴增與測序 將固氮菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)（28℃，180 r/min）培養(yǎng)24 h，按照細菌DNA提取試劑盒步驟，提取固氮菌的DNA，利用細菌通用引物16s-F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 16s-R1387（5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3'）為引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物膠回收后，上海生工測序，將測序結(jié)果提交NCBI進行同源序列的比對。

1.2.3 固氮酶活性測定 利用氣相色譜結(jié)合乙炔還原法測定固氮酶活性。將待測菌株接種于Ashby 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，取1 mL 接種于的含10 mL Ashby液體培養(yǎng)基的60 mL 磨口小口瓶中，再培養(yǎng)24 h，然后抽出5 mL氣體，再注入5 mL 乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，上機檢測。

1.2.4 1-氨基-環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶 將保存在-80℃的固氮菌株活化，按1%（V/V）的比例將活化后的菌液接種于無氮培養(yǎng)基中，28℃條件下過夜培養(yǎng)，離心（1 200 r/min，10 min），收集菌體，用5 mL的DF培養(yǎng)基洗滌菌體2次，將菌體重懸于5 mL的ADF培養(yǎng)基中，28℃條件下過夜培養(yǎng)，離心（1 200 r/min，10 min），收集菌體。0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）緩沖液洗沖洗菌體2次，再次將菌體重懸于600 μL的 0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 8.5）緩沖液，加入30 μL的甲苯。取200 μL提取液與20 μL的0.5 mol/L的ACC溶液混合，30℃條件下孵育15 min，然后加300 μL的0.2% 的2，4-二硝基苯肼，30℃條件下孵育30 min，最后，加入2 mL的2 mol/L NaOH 溶液，利用紫外分光光度計測吸光率（OD=540 nm）。以牛血清蛋白為標準，以每分鐘形成1 μmol α-酮丁酸鹽為一個酶活單位。

1.2.5 解磷特性的測定 挑取保存在LB斜面的固氮菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h。調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1×108CFU/mL，按1%（V/V）的比例將待測菌株分別接種于含有不同P源無機磷培養(yǎng)基（TPM）和有機磷培養(yǎng)基（YM）的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)（28℃，180 r/min）3 d，每株菌設(shè)3 次重復(fù)，以不接菌作為空白對照。采用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液中可溶性磷含量（OD=600 nm）。pH計測定培養(yǎng)基pH值的變化［13］。

1.2.6 分泌IAA量測定 將待測菌株接種于含有200 μg/mL色氨酸的LB培養(yǎng)基中，在28℃條件下180 r/min，培養(yǎng) 3 d。離心（1 200 r/min，10 min），得到上清液，取5 mL的上清液加入到10 mL的試管中，然后加入等體積的salkowski比色液（0.5 mol/L的氯化鐵10 mL加入到35%的高氯酸中，總體積500 mL）避光靜止30 min顯色，測其分光光度，以空白組作為對照（OD=530 nm）。

1.2.7 耐鹽堿水平測定 分別配制含不同NaCl濃度（0、0.5、1、1.2和1.5 mol/L）和不同起始pH 值（7、8、9和10）的LB液體培養(yǎng)基中，各濃度設(shè)3次重復(fù)。將供試菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃，過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1× 108CFU/mL，制成接種液，按1% 的接種量（100 mL 培養(yǎng)基接種1 mL接種液），分別轉(zhuǎn)接至含不同NaCl濃度及不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（28℃，180 r/min）培養(yǎng)3 d，紫外分光光度計下測定其OD值（OD=600 nm），以O(shè)D值的大小表示其在各水平下的生長繁殖情況。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選鑒定

對土壤樣品稀釋后進行涂布實驗，初步得到菌株58株，利用乙炔還原法測定所分離的固氮菌株的固氮酶活，其中具有固氮能力的共22株，其固氮酶活性在 125.82-346.32 nmol C2H4/（h·mL）（表1），以16s-F27和16s-R1387為引物對菌株擴增及16S rDNA 正向測序，得到的序列通過BLAST與GenBank 數(shù)據(jù)庫中序列進行比對，結(jié)果如圖1所示。這些菌株屬于4個菌屬，其中，13株菌株屬于Stenotrophomonasspp.，占總數(shù)的59%，為優(yōu)勢菌群；6株菌株屬于Enterobacterspp.，2株菌株屬于Pseudomonassp.，1 株屬于Aeromonassp.。

2.2 IAA含量

利用比色法對分離得到的22株菌株分泌IAA特性進行測定，培養(yǎng)基各菌株的顯色反應(yīng)與分泌IAA的量成正相關(guān)，即顏色反應(yīng)越明顯，其產(chǎn)生IAA的量越大。結(jié)果（表1）顯示，10株可以分泌IAA，分泌量在1.36-17.80 μg/mL，占供試菌株的54%。CNJ-1的分泌量最小，其分泌量為1.36 μg/mL；濃度大于10 μg/mL的菌株只有2株，分別是GNJ-2（12.90 μg/mL）和 GNJ-32（10.23 μg/mL）。

圖1 基于16S DNA 基因序列構(gòu)建固氮菌進化樹

表1 固氮菌株的固氮酶活及分泌IAA量

2.3 產(chǎn)ACC脫氨酶特性

ACC脫氨酶活性測定結(jié)果（圖2）顯示，所有菌株均具有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力，其產(chǎn)量為0.12-1.26 U/mg。其中，ACC脫氨酶活性最大的菌株為GNJ27（1.26 U/mg）， 其 次 為 GNJ32（1.12 U/mg），這兩株菌均屬于Stenotrophomonasspp.。ACC脫氨酶活性最小的為Aeromonassp. GNJ1，其產(chǎn)量為0.12 U/mg。

圖2 菌株ACC脫氨酶活性測定

2.4 溶磷特性

液體培養(yǎng)測定菌株的溶磷性，結(jié)果如圖3所示。所篩選的菌株均具有溶解磷酸三鈣的能力，其溶磷量1.45-53.58 mg/L之間。其中，編號GNJ-4，GNJ-13，GNJ-14，GNJ-16，GNJ-18，GNJ-20，GNJ-27，GNJ-32，GNJ-51溶磷酸三鈣的能力相對較高，培養(yǎng)基內(nèi)可溶性磷含量都在10 mg/L以上，而其他的菌株溶磷量大多在1-10 mg/L左右，相對較少。而且隨著培養(yǎng)基可溶性磷含量的增加，培養(yǎng)基的pH有所下降，其下降范圍由初始的7下降到3.14。以磷酸鐵為不溶性P源時，培養(yǎng)基內(nèi)可溶性磷含量為1.45-8.27 mg/L。其中編號GNJ-4，GNJ-16，GNJ-20，GNJ-27，GNJ-28，GNJ-40的能力較高，溶磷含量在5 mg/L以上，而其余菌株大多在2-4 mg/L左右波動。當以磷酸鋁為不溶性磷源時，培養(yǎng)基內(nèi)可溶性磷含量1.1-22.82 mg/L，其中編號GNJ-2，GNJ-27，GNJ-51的溶磷能力相對較高，其余菌株大多在6 mg/L左右。所有培養(yǎng)基的pH均隨著培養(yǎng)基內(nèi)可溶性磷含量增加而下降。這說明，固氮菌在溶磷的過程中其可以釋放某些酸性物質(zhì)，進而降低培養(yǎng)基的pH。

圖3 固氮菌株溶解難溶性磷

2.5 耐鹽堿特性

選取10株具有固氮、溶磷及分泌IAA特性的多功能菌株進行耐鹽堿實驗。結(jié)果（圖4）表明，不同菌種的鹽耐受能力不同。大部分固氮菌株隨著NaCl濃度的增加，菌體生長受到抑制，生物量下降；其中固GNJ-27和GNJ-40最適生長NaCl 濃度為0.5 mol/L ；GNJ-2，GNJ-15，GNJ-40在 1.5 mol/L NaCl 條件下仍可生存，其耐鹽性最強。所有菌株的耐受pH值范圍為7-9（圖5）。其中GNJ-1，GNJ-20，GNJ-27的最適生長pH值為7；GNJ-2，GNJ-5，GNJ-13，GNJ-14，GNJ-32的最適生長pH值為8；GNJ-15和GNJ-40的最適適生長pH值為9。

圖4 固氮菌株的NaCl耐受性

圖5 固氮菌株的pH耐受性

3 討論

鹽堿地植物根系分布著很多耐鹽堿根際促生菌，這些菌株能夠增植物的耐堿性，促進植物生長。目前，鹽堿地中多種植物根際促生菌已成功篩選出來［9-10］。本實驗利用Ashby培養(yǎng)基首次從鹽堿地花生根際分離具有固氮能力的土著菌株，篩選出具有固氮能力的菌株22株，分屬Aeromonasspp.，Pseudomonasspp.，Enterobacterspp.，和Stenotropho-monasspp.，4個種群。Stenotrophomonasspp.占總數(shù)的54%，為優(yōu)勢種群。這4個種群在黃瓜、小麥、水稻中均有相關(guān)報道，可以緩解鹽脅迫損傷［14-15］。

氮是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，微生物能夠固定大氣中的氮氣，為植物提供氮素營養(yǎng)，進而促進植物生長。王超群等［16］從大豆根際分離的4 株固氮菌，最大固氮酶活為263. 40 nmol C2H4/（h·mL），最小固氮酶活為183.09 nmol C2H4/（h·mL）。本實驗分離得到菌株的固氮酶活性最高為346.32 nmol C2H4/（h·mL），最低為125.82 nmol C2H4/（h·mL）?？梢?，本實驗所分離的促生菌株具有較高的固氮酶活性。有研究表明，固氮菌不但可以固定空氣中的氮氣，同時一些固氮菌還兼具產(chǎn)ACC脫氨酶，溶磷及分泌IAA的特性［17］。

ACC脫氨酶是許多植物根際促生細菌共有的一個特征性酶，在植物抵抗高溫、高鹽、寒冷及病害等逆境脅迫中發(fā)揮中重要作用。乙烯是植物生長發(fā)育的代謝產(chǎn)物，鹽堿條件下，植物體內(nèi)的乙烯水平會顯著上升，進而影響植物生長。ACC脫氨酶是一種抑制乙烯生物合成的胞內(nèi)酶，具有分泌ACC脫氨酶活性的微生物接種在植物根際時，能夠降低植物由于鹽脅迫產(chǎn)生的過量乙烯濃度，促進植物生長。許芳芳等［18］研究表明接種具有ACC脫氨酶活性的腸桿菌（Enterobactersp.），顯著提高了鹽脅迫下小麥的生長性狀，葉綠素含量19%，生物量提高54%，根長增加了46%。ACC脫氨酶活性是評價菌株是否可被制作成微生物肥料的指標之一。本實驗所篩選的固氮菌株均具有ACC脫氨酶活性。趙龍飛等［19］研究表明具有固氮酶活性的腸桿菌屬（Enterobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），同時具有產(chǎn)ACC脫氨酶的活性。

本實驗所篩選的促生菌株中，所有菌株均具有溶磷性能，其中GNJ-18的最大溶磷量為53.58 mg/L。這與Sharma等［20］分離自花生根部的PGPR研究結(jié)果基本一致。而在分泌IAA特性方面，不同菌株的差異較大。鄭娜等［21］從鹽堿土壤中分離4株 菌（Pseudomonas protegens、Achromobactersp.、Variovoraxsp. 和P. protegens），其中3株具有分泌IAA的能力，產(chǎn)量最高達到160.55 μg/mL，但最低的只有0.10 μg/mL。本實驗中，有45%的促生菌株具有分泌IAA的能力，濃度為1.36-12.9 μg/ml。Liu等［22］分離自菊芋根際的耐鹽堿固氮菌中僅有一株具有產(chǎn)IAA能力，且分泌量僅為1.1 μg/ml，接種該菌株成功的促進了菊芋生長。IAA不但可以促進細胞生長，增加細胞體積和重量，直接促進植物生長。而且，通過接種分泌IAA的菌株，能夠增加植物根表面積和長度，從而使植物能夠獲得更多營養(yǎng)物質(zhì)［23］。這表明分離的促生菌具有應(yīng)用于鹽堿土壤中增加可利用營養(yǎng)元素含量的潛力。

本實驗探究多功能菌株在不同NaCl及pH下的生長情況，發(fā)現(xiàn)所有菌株對NaCl具有較好的適應(yīng)性，其中GNJ-2，GNJ-20和GNJ-27在NaCl濃度為1.5 mol/L條件下能夠生長，遠高于孫建光等［24］篩選自玉米固氮菌株的NaCl耐受性。牛艷芳等［25］篩選自非鹽堿土壤中的固氮菌株的最適生長pH 值均集中在6-8。而本實驗所篩選的固氮菌株的最適生長pH值范圍為7-9。這說明，分離自鹽堿地植物根際的微生物對鹽堿環(huán)境耐受性較好。薛婷婷等［26］對黃河三角洲鹽堿地固氮菌的pH耐受性研究也證實了這一觀點。因此，本研究所篩選的促生菌能夠更好的適應(yīng)鹽堿環(huán)境，在制備鹽堿地微生物菌肥方面具有較大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

根際促生菌能夠通過固氮、產(chǎn)ACC脫氨酶，溶磷及分泌IAA等機制緩解植物鹽脅迫損傷，改良鹽堿土壤。本實驗以黃河三角洲鹽堿地花生根際土壤為研究對象，經(jīng)固氮酶活的測定及16S rDNA鑒定，篩選得到22株具有固氮能力的菌株。所有菌株均具有產(chǎn)ACC脫氨酶及溶解難溶性無機磷源活性，有10株固氮菌株可以分泌IAA。這10株菌株具有良好的鹽堿耐受性，在鹽堿地微生物菌肥方面具有較大的開發(fā)潛力。