正天丸對偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體c-f os、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶表達(dá)的影響※

李 慧,白方會,伍志勇,吳艷華,陳寶田

(1.廣州市紅十字會醫(yī)院/暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會醫(yī)院,廣東 廣州510220;2.河南省南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽473003;3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院,廣東 廣州510515)

偏頭痛是一種常見的原發(fā)性頭痛,表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作、單側(cè)或雙側(cè),中重度搏動樣頭痛。流行病學(xué)資料顯示[1],我國偏頭痛的發(fā)病率為9.3%。2016年全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示偏頭痛致殘性在中國排第5位[2]。其發(fā)病機制尚未明確,但大量研究表明三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活具有重要意義[3]。三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體(TCC)是三叉神經(jīng)二級神經(jīng)元,當(dāng)偏頭痛發(fā)作時TCC興奮性增高,進(jìn)一步向中樞傳遞疼痛信號,最終導(dǎo)致偏頭痛。即刻早期基因c-f os是神經(jīng)元激活的標(biāo)志物,細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)參與多種神經(jīng)可塑性變化如痛覺的產(chǎn)生和維持,兩者在偏頭痛的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用[4]。

《素問·痹論》說：“痛者寒氣多也,有寒故痛也?！毙翜厮幠苌⒛苄?能祛風(fēng)寒通氣血,通則不痛,故可止痛。正天丸是臨床治療偏頭痛的主要中成藥,其組成藥物多為辛溫之性。大量臨床研究和實驗研究表明,正天丸對偏頭痛止痛療效確切[5-7]。本研究擬通過觀察正天丸對硝酸甘油(NTG)誘發(fā)偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體即刻早期基因c-f os、ERK表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討正天丸對偏頭痛疼痛的防治機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量(280±20)g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房,12 h節(jié)律,室內(nèi)溫度22～26℃,濕度40%～60%,自由攝取充足的水和飼料,實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。實驗過程中對動物的處置遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 試劑及儀器 硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H11020289);正天丸(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z44020711);10%水合氯醛(上海五聯(lián)化工廠);4%多聚甲醛溶液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);c-f os兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology);免疫熒光二抗-抗兔Cy3(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);p-ERK(Santa Cruz Biotechnology);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);BCA試劑盒和ECL發(fā)光液購于碧云天試劑有限公司;Sy BrI熒光定量試劑盒、MX3005P熒光定量PCR儀(Stratagene公司);IS 2000 MM圖像工作站(Kodak)。

1.3 造模與分組 按照隨機數(shù)字表法將SD大鼠隨機分為3組,每組10只,分別為空白組、模型組、治療組。治療組給予正天丸灌胃,劑量為1.62 g/(kg·d),按照成人常規(guī)口服量根據(jù)體表面積計算法換算;空白組和模型組大鼠給予相同劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠連續(xù)給藥7 d。模型組、治療組大鼠末次灌胃30 min后通過左肩皮下注射硝酸甘油注射液(10 mg/kg)制備偏頭痛大鼠模型,空白組大鼠左肩部皮下注射相同劑量生理鹽水。造模4 h后取材。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 行為學(xué)觀察 偏頭痛大鼠造模成功表現(xiàn)為：耳朵發(fā)紅、前肢持續(xù)撓頭、頻繁爬籠、煩躁不安等。記錄指標(biāo)：①記錄模型組和治療組大鼠造模后耳紅出現(xiàn)和消失時間;②將連續(xù)撓頭5次以上定義為持續(xù)撓頭,記錄模型組和治療組大鼠造模后持續(xù)撓頭出現(xiàn)和消失時間;③記錄每30 min大鼠爬籠次數(shù),連續(xù)記錄3 h。

1.4.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

(1)免疫熒光 各組大鼠造模4 h后,每組分別取5只行10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露心臟,剪開右心耳,4℃生理鹽水快速灌注至流出液清亮,4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取延髓至上頸段脊髓(至第2頸椎),4%多聚甲醛固定,蔗糖脫水。石蠟包埋切片,片厚10μm。切片進(jìn)行脫蠟和水化、熱抗原修復(fù)、滅火內(nèi)源性過氧化物酶、封閉液封閉,加入一抗c-f os兔單克隆抗體(1∶200,#2250),過夜。滴加熒光二抗抗兔Cy3(Cat：KGIF010 1∶500),避光孵育1 h,PBS漂洗,加抗淬滅劑,中性樹膠封片,倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,紅色高亮為標(biāo)記的c-f os。

(2)蛋白質(zhì)印跡法(Wester n blotting) 造模4 h后,冰上取延髓至上頸段脊髓(至第2頸椎),-80℃液氮保存。將組織加液氮研磨后,加入150μL RIPA裂解液及1.5μL PMSF冰上孵育30 min,1 500 r p m 4℃離心15 min,取上清液,BCA法測定蛋白濃度。每個樣本各取50μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)PDVF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST沖洗3次,加入一抗(1∶1 000),孵育過夜,HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育l h,TBST沖洗3次,ECL化學(xué)發(fā)光法在IS 2000 MM成像系統(tǒng)(Kodak)進(jìn)行曝光拍照,Molecular Imaging Soft ware Version 4.0(Kodak)軟件分析條帶灰度值,以β-actin作為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次,計算均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。方差齊時采用單向方差分析或t檢驗進(jìn)行組間比較,方差不齊時采用Welch近似方差分析法進(jìn)行組間比較;整體組間比較有差異時,進(jìn)一步采用Bonferroni法(方差齊時用)或Dunnett′s T3法(方差不齊用)進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠未出現(xiàn)耳朵發(fā)紅,無連續(xù)撓頭,偶有爬籠;模型組和治療組大鼠在造模后均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、持續(xù)撓頭及頻繁爬籠現(xiàn)象,提示造模成功。兩組耳紅出現(xiàn)和撓頭開始時間比較均無明顯差異,但治療組耳紅消失時間和撓頭結(jié)束時間均較模型組提前,持續(xù)時間較短。治療組在30 min后各時間段爬籠次數(shù)較模型組顯著降低。見表1、表2。

表1 兩組偏頭痛模型大鼠耳紅及持續(xù)撓頭時間比較(min,ˉ±s)

表1 兩組偏頭痛模型大鼠耳紅及持續(xù)撓頭時間比較(min,ˉ±s)

注：與模型組比較,△P＜0.01

組別 耳紅出現(xiàn)時間 耳紅消失時間 撓頭開始時間 撓頭結(jié)束時間治療組 3.96±0.17 102.79±2.38△ 4.01±0.19 102.43±2.39△模型組 3.88±0.27 132.55±3.78 3.86±0.21 134.41±11.74

表2 兩組偏頭痛模型大鼠各時間段爬籠次數(shù)比較(次±s)

表2 兩組偏頭痛模型大鼠各時間段爬籠次數(shù)比較(次±s)

注：與模型組同時間比較,△P＜0.01;與空白組同時間比較,▲P＜0.01

180 min治療組28.00±1.56▲ 18.10±1.52△▲11.9±1.37△▲ 9.10±1.37△▲ 3.90±0.74△▲ 2.20±0.63△組別 0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～空白組 1.80±0.20 1.90±0.73 2.10±0.57 0.19±0.74 2.10±0.74 2.10±0.57模型組28.90±1.60▲ 23.10±2.02▲ 18.00±1.05▲ 12.90±1.79▲ 8.40±0.97▲ 4.20±1.48▲

2.2 免疫熒光結(jié)果 空白組、模型組和治療組大鼠三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體內(nèi)均有c-fos陽性表達(dá)(圖中紅色熒光顆粒),空白組表達(dá)量較少,模型組c-fos蛋白呈明顯高表達(dá)狀態(tài),治療組表達(dá)亮度較模型組降低。見圖1(本期第109頁)。

2.3 Wester n bl otting結(jié)果 結(jié)果顯示p-ERK/ERK的比值分別為：空白組(0.67±0.01),模型組(0.97±0.03),治療組(0.77±0.00)。方差齊性檢驗結(jié)果顯示F=4.668,P=0.036,方差不齊,采用 Welch近似方差分析法進(jìn)行組間比較,整體組間比較有差異(P＜0.01),進(jìn)一步采用Dunnett′s T3法進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較,結(jié)果顯示模型組p-ERK/ERK較空白組明顯增加(F=82.666,P=0.004),治療組p-ERK/ERK受體蛋白表達(dá)較模型組明顯降低(F=82.666,P=0.006)。見圖2、圖3(本期第109頁)。

3 討論

偏頭痛是西醫(yī)病名,歸屬于中醫(yī)“頭痛”“偏頭風(fēng)”范疇。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對頭痛的病名、病因病機和治則描述可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！端貑枴の迮K生成》曰“是以頭痛顛疾,下虛上實”。四氣五味是中醫(yī)基本藥性理論,“辛”作為五味之一,能散、能行,有發(fā)散、行氣、行血等作用。“溫”作為4種藥性之一,能散寒助陽。正天丸是全國名老中醫(yī)陳寶田教授在經(jīng)方的基礎(chǔ)上結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗化裁得到,其大多數(shù)藥物為辛溫之藥。正天丸以川芎為君藥,味辛,性溫,具有活血祛瘀、行氣開郁、祛風(fēng)止痛之功效。方中配麻黃、細(xì)辛、附子,能加強川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛之力。鉤藤息風(fēng)定驚;白芍柔肝止痛;羌活祛濕止痛;獨活通痹止痛,用于少陰伏風(fēng)頭痛;防風(fēng)味辛,性溫,勝濕止痛,以上為臣藥,能加強川芎祛風(fēng)散寒止痛之力。地黃養(yǎng)陰生津,當(dāng)歸活血止痛,雞血藤活血通絡(luò),桃仁活血化瘀,紅花散瘀止痛,皆為佐藥,以助川芎活血化瘀止痛。白芷祛風(fēng)止痛,是正天丸中的佐使藥。作為治療偏頭痛的首選中成藥,正天丸的臨床療效得到廣大醫(yī)者和患者的好評[6-7],但其作用機制尚未明確。

近年來,越來越多的臨床和實驗研究表明,ERK在神經(jīng)的可塑性變化如痛覺等的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用[8]。磷酸化的ERK也是神經(jīng)元被傷害性信息激活的標(biāo)志物。實驗研究表明,ERK參與神經(jīng)疼痛形成的可能機制是：慢性損傷促使p-ERK細(xì)胞核核內(nèi)轉(zhuǎn)移,使其下游信號CREB磷酸化,改變目的基因c-f os的表達(dá)[9]。在通過大鼠皮下注射福爾馬林導(dǎo)致的急性疼痛模型中,三叉神經(jīng)脊束核存在客觀數(shù)量p-ERK的表達(dá),說明了ERK是三叉神經(jīng)脊束核傳導(dǎo)傷害性刺激的介質(zhì)[10]。在硝酸甘油導(dǎo)致的偏頭痛大鼠模型中,活化的肥大細(xì)胞誘發(fā)了延遲性痛覺過敏[11],同時可以導(dǎo)致p-ERK在三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)增加,也和偏頭痛發(fā)作時的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)和中樞性致敏反應(yīng)相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠TCC中p-ERK的表達(dá)較正?？瞻捉M明顯增加,說明給予NTG皮下注射后,激活了TCC的ERK信號通路,再次驗證了ERK的磷酸化參與了偏頭痛發(fā)作過程中的痛覺信息傳遞。治療組的p-ERK表達(dá)較模型組降低,表明抑制ERK信號的活化也可能是正天丸治療偏頭痛的作用機制之一。

c-f os既是ERK信號通路的下游因子,也是傷害性信息激活神經(jīng)元的標(biāo)志物[13]。在本研究中,硝酸甘油偏頭痛模型大鼠的三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體呈明顯高表達(dá)狀態(tài),對c-f os蛋白水平的檢測間接的反映出三叉神經(jīng)感覺神經(jīng)元的激活狀態(tài)。本研究的結(jié)果顯示硝酸甘油皮下注射4 h后,c-fos在偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體內(nèi)呈明顯陽性表達(dá),表明三叉神經(jīng)感覺神經(jīng)元成功激活。有文獻(xiàn)報道應(yīng)用硝酸甘油4 h后,三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)部,中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、視上核、室旁核等感受痛覺信息的相關(guān)腦區(qū)均可見c-fos的明顯陽性表達(dá)[14],更進(jìn)一步支持了我們結(jié)果的可靠性。正天丸可以抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)感覺神經(jīng)元的激活。

綜上所述,三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體中ERK表達(dá)上調(diào)參與了偏頭痛的發(fā)作,辛溫止痛法正天丸可以通過降低偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體內(nèi)c-f os、ERK的過表達(dá),達(dá)到減輕偏頭痛疼痛的作用,為其臨床療效提供了有力的理論依據(jù)。但偏頭痛的發(fā)病機制涉及面廣,正天丸對其他神經(jīng)遞質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。