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      尼群地平片人體生物等效性預(yù)研究

      2019-05-16 09:30:38魯婷婷崔佳麗趙高瓊李竇紅劉紅斌王京昆
      云南化工 2019年2期
      關(guān)鍵詞:尼群地平餐后內(nèi)標(biāo)

      魯婷婷,崔佳麗,梅 晶,趙高瓊,李竇紅,劉紅斌 ,王京昆

      (1.大理大學(xué),云南 大理 671000;2.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;3.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心,云南 昆明 650111;4.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室,云南 昆明 650111)

      尼群地平為德國拜耳公司 (Bayer Vital GmbH)研發(fā)的二氫吡啶類鈣離子拮抗劑,由于起效迅速、療效確切、副作用小等特點,被廣泛應(yīng)用于治療各類型高血壓及冠心病[1]。截止2012年,我國已有191家企業(yè)仿制生產(chǎn)尼群地平片[2]。為促使企業(yè)全面提高仿制藥質(zhì)量,國家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量一致性評價工作的通知》中提出:“對2007年修訂的《藥品注冊管理辦法》施行前批準(zhǔn)基本藥物和臨床常用仿制藥,分期分批進(jìn)行質(zhì)量一致性評價”[3]。而生物等效性 (bioequivalence,BE)評價是仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價的重點內(nèi)容之一[4-5]。只有仿制藥與原研藥具有生物等效性,臨床上才可以仿制藥替代原研藥[6]。本研究進(jìn)行空腹?fàn)顟B(tài)和餐后狀態(tài)下尼群地平受試制劑與參比制劑生物等效性預(yù)研究,以期獲得尼群地平生物等效性評價結(jié)果,為尼群地平片生物等效性正式試驗的設(shè)計提供參考和指導(dǎo)。

      1 儀器和試藥

      1.1 儀器

      Agilent 1200SL HPLC(美國安捷倫科技有限公司)、API3200 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國AB公司)、Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)、DV215CD電子天平 (上海OHAUS公司)。

      1.1 藥品與試劑

      受試制劑:尼群地平片(云南白藥集團(tuán)股份有限公司,批號ASPL201702,規(guī)格10 mg);參比制劑:尼群地平片(Bayer Vital GmbH,批號BJ33777,規(guī)格10 mg)。尼群地平對照品(中國食品藥品檢定研究院,含量為99.4%,批號:100585-201705);內(nèi)標(biāo):氘代尼群地平(TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC,批號:15-BHW-78-4);甲酸、乙腈為色譜純,水為超純水。

      2 試驗方法

      2.1 血漿樣品分析方法的建立

      2.1.1 血漿樣品處理方法

      精密量取100 μL血漿,置1.5 mL棕色離心管中,加入200 μL的內(nèi)標(biāo)沉淀劑,渦旋3 min,于15000 r·min-1,4℃離心10 min后,取上清液進(jìn)行分析檢測。

      2.1.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

      色譜條件:色譜柱為 XBridge○RBEH C18柱(4.6mm×75mm,2.5μm);流動相為0.1%甲酸水-乙腈,洗脫梯度為0.0~2.0 min,乙腈10%;2.0~7.5 min,乙腈90%;7.5~12 min,乙腈10%;柱溫為20℃;流速為350 μL·min-1;進(jìn)樣量為10 μL。

      質(zhì)譜條件:電噴霧離子源 (ESI),多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)方式進(jìn)行負(fù)離子檢測,對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù),噴霧電壓 (IS):-4500 V,霧化溫度 (TEM):600℃,氣簾氣(CUR):30 psi,霧化氣 (GS1):85 psi,輔助氣(GS2):60 psi,碰撞氣 (CAD):Low;尼群地平[M-H]-母離子m/z:359.10,定量/定性碎片離子m/z:122.00/236.00;解簇電壓(DP):-40V/-50 V,射入電壓(EP):-5V/-5V,碰撞池入口電壓(CEP):-15 V/-13 V,碎裂電壓 (CE):-26V/-25 V,碰撞室射出電壓(CXP):-2 V/-2 V;氘代尼群地平 [M-H]-母離子m/z:364.10,定量/定性碎片離子m/z:122.00/241.10;解簇電壓(DP):-50V/-50 V,射入電壓 (EP):-5V/-5 V,碰撞池入口電壓(CEP):-15 V/-15 V,碎裂電壓 (CE):-27 V/25 V,碰撞室射出電壓(CXP):-2 V/-2 V。

      2.2 溶液的配置

      精密稱定尼群地平對照品5.84mg于10 mL棕色容量瓶,用乙腈溶解并定容稀釋成濃度分別為1.97、4.93、14.8、44.3、133、400ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液;同法精密稱定尼群地平對照品5.26mg和內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平對照品2.60 mg用乙腈分別稀釋成質(zhì)量濃度分別為 3.90、82.0、328ng·mL-1的質(zhì)控工作液和質(zhì)量濃度為2.08 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)沉淀劑。

      2.3 分析方法的確證

      2.3.1 特異性

      測定空白血漿樣品、空白血漿加標(biāo)樣品及任一志愿者服藥后的未知濃度血漿樣品,由尼群地平、氘代尼群地平定量離子對(m/z359.10→m/z122.00、m/z 364.10→m/z122.00) 的提取離子流圖可知,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾尼群地平和內(nèi)標(biāo)的測定,方法的特異性良好。

      2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

      配制血藥質(zhì)量濃度為 0.197、0.493、1.48、4.43、13.3、40.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,進(jìn)樣檢測,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.284X+0.00962(r=0.9996),結(jié)果表明,尼群地平血藥質(zhì)量濃度在0.197~40.0 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量下限為 0.197 ng·mL-1。2.3.3 精密度與準(zhǔn)確度

      處理定量下限、低、中、高4個質(zhì)量濃度(0.197、0.390、8.20、32.8 ng·mL-1)的血漿樣品各6份,連續(xù)3天,進(jìn)樣檢測,得批內(nèi)準(zhǔn)確度為88.32%~111.28%,批內(nèi)精密度為RSD%為1.75%~6.42%,批間準(zhǔn)確度為102.03%~106.15%,批間精密度為RSD%為2.83%~10.95%,符合生物樣本分析檢測要求。

      2.3.4 提取回收率

      配制質(zhì)量濃度分別為0.390、8.20、32.8 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品,每樣6份,與相應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液以水代替血漿同法配制的6份樣品比較,計算提取回收率,3個質(zhì)量濃度尼群地平的提取回收率分別為 (106.14±4.82)%,(103.93±3.22) %和 (101.53±4.50) %,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為4.53%、3.10%和4.43%,平均提取回收率為103.89%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%為2.22%,回收對尼群地平及內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的影響較小,符合生物樣本分析檢測要求。

      2.3.5 基質(zhì)效應(yīng)

      圖1血漿中尼群地平和內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of nitrendipine(m/z359.10 →m/z122.00,1) and nitrendipine-d5(m/z 364.10 →m/z122.00,2) in plasma samples

      處理低、中、高(0.390、8.20、32.8ng·mL-1)3個質(zhì)量濃度的尼群地平基質(zhì)樣品,每濃度各6份,與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品以水代替血漿照“血漿樣品的預(yù)處理”方法操作處理后的6份樣品進(jìn)樣比較,計算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng),尼群地平各質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)分別為(112.85±4.20) % , (111.56±4.42) % 和 (111.84 ±4.23)%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為3.72%、3.96%、3.78%,平均內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)為112.20%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%為0.61%,基質(zhì)對尼群地平及內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的影響較小,滿足生物樣品分析檢測要求。

      2.3.6 穩(wěn)定性

      取低、中、高3個質(zhì)量濃度(3.90、82.0、328ng·mL-1)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液各15份,室溫氮氣吹干,加入100 μL空白血漿,渦勻,分別考察室溫避光放置10 h和室溫不避光放置3 h及處理后放置7d的穩(wěn)定性。結(jié)果所有樣品相對偏差RE%在-10.37%~8.21%范圍內(nèi),RSD%在1.23%~8.49%范圍內(nèi),表明尼群地平血漿樣本在上述條件下均穩(wěn)定。

      2.4 臨床試驗

      試驗方案實施前經(jīng)倫理委員會審查批準(zhǔn),16名健康志愿者體格檢查、心電圖檢查和實驗室檢查均正常。試驗前兩周至試驗結(jié)束未使用影響尼群地平片體內(nèi)過程或安全性評價的藥物或食物,自愿簽署知情同意書,采用自身交叉對照設(shè)計,將志愿者隨機(jī)分為空腹給藥組和餐后給藥組,空腹給藥組服藥前禁食10h,餐后給藥組服藥前禁食10h并于服藥前30 min內(nèi)進(jìn)食高脂高熱量餐,服藥劑量為10 mg,清洗期7天,服藥前(1 h內(nèi)) 及服藥后0.5 h、0.75 h、1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h采集靜脈血,所采血液在3000 r·min-1,2~8℃條件下離心10 min,然后分離血漿樣品,于-80℃冰箱中保存待測(全血采集和離心分裝等均在避光環(huán)境下進(jìn)行操作)。

      圖2 志愿者空腹?fàn)顟B(tài) (A)和餐后狀態(tài) (B)下服用兩種制劑后平均血藥濃度-時間曲線 (n=8)Figure.2 Mean plasma concentration-time curves of oral administration of twopreparation under fasting (A)and fed (B)conditions in healthy volunteers(n=8)

      2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

      采用DAS3.3.0軟件非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù),對藥動學(xué)參數(shù)AUC和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析和雙單側(cè)t檢驗,以AUC和Cmax的90%置信區(qū)間 (90%CI)評價尼群地平片的生物等效性。以多因素方差分析得到的殘差(mean square error,MSE)[7],采用 DAS3.3.0 軟件計算尼群地平空腹服藥及餐后服藥Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的個體內(nèi)變異和個體間變異。

      3 結(jié)果

      3.1 藥-時曲線

      志愿者餐后或空腹服用尼群地平參比制劑和受試制劑平均血藥濃度-時間曲線,見圖2。

      3.2 藥動學(xué)參數(shù)

      采用DAS3.3.0軟件計算得到的藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

      3.3 生物等效性評價

      尼群地平片空腹?fàn)顟B(tài)或餐后狀態(tài)服藥后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 90%CI 結(jié)果見表 2。Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 90%CI均超出 80%~ 125%,尼群地平兩制劑不符合生物等效性假設(shè),餐后服藥藥動學(xué)參數(shù)AUC在個體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義

      表2 受試者空腹及餐后狀態(tài)下經(jīng)口給予受試制劑與參比制劑后等效性統(tǒng)計檢驗Tab.2 Statistical test of bioequivalence after oral administration of test or reference preparation under fasting and high-fat diet conditions

      (P<0.05),空腹服藥藥動學(xué)參數(shù)Cmax在個體間、AUC在個體間及藥物間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

      空腹服用尼群地平片后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞個體內(nèi)變異為24.43%、22.87%、22.38%,個體間變異為39.71%、42.88%、43.84%;餐后服用尼群地平片后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞個體內(nèi)變異為64.20%、21.03%、23.06%,個體間變異為52.93%、57.60%、68.60%。

      4 討論

      藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC個體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,可能與尼群地平藥物本身個體間變異有關(guān)[8],空腹?fàn)顟B(tài)或餐后狀態(tài)服藥后藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC置信區(qū)間均超出80%~125%,兩個企業(yè)生產(chǎn)的尼群地平片生物不等效,說明受試制劑與原研藥仍存在一定差距,提示后續(xù)需要繼續(xù)優(yōu)化尼群地平片處方、改善制劑工藝,以期獲得等效性結(jié)果。

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