尼群地平片人體生物等效性預(yù)研究

魯婷婷，崔佳麗，梅 晶，趙高瓊，李竇紅，劉紅斌 ，王京昆

（1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；4.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111）

尼群地平為德國拜耳公司 (Bayer Vital GmbH)研發(fā)的二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，由于起效迅速、療效確切、副作用小等特點，被廣泛應(yīng)用于治療各類型高血壓及冠心病[1]。截止2012年，我國已有191家企業(yè)仿制生產(chǎn)尼群地平片[2]。為促使企業(yè)全面提高仿制藥質(zhì)量，國家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量一致性評價工作的通知》中提出:“對2007年修訂的《藥品注冊管理辦法》施行前批準(zhǔn)基本藥物和臨床常用仿制藥，分期分批進(jìn)行質(zhì)量一致性評價”[3]。而生物等效性 (bioequivalence，BE)評價是仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價的重點內(nèi)容之一[4-5]。只有仿制藥與原研藥具有生物等效性，臨床上才可以仿制藥替代原研藥[6]。本研究進(jìn)行空腹?fàn)顟B(tài)和餐后狀態(tài)下尼群地平受試制劑與參比制劑生物等效性預(yù)研究，以期獲得尼群地平生物等效性評價結(jié)果，為尼群地平片生物等效性正式試驗的設(shè)計提供參考和指導(dǎo)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1200SL HPLC（美國安捷倫科技有限公司）、API3200 Q-Trap質(zhì)譜儀（美國AB公司）、Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）、DV215CD電子天平 （上海OHAUS公司）。

1.1 藥品與試劑

受試制劑:尼群地平片（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號ASPL201702，規(guī)格10 mg）；參比制劑:尼群地平片（Bayer Vital GmbH，批號BJ33777，規(guī)格10 mg）。尼群地平對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量為99.4%，批號:100585-201705）；內(nèi)標(biāo):氘代尼群地平（TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC，批號:15-BHW-78-4）；甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 試驗方法

2.1 血漿樣品分析方法的建立

2.1.1 血漿樣品處理方法

精密量取100 μL血漿，置1.5 mL棕色離心管中，加入200 μL的內(nèi)標(biāo)沉淀劑，渦旋3 min，于15000 r·min-1，4℃離心10 min后，取上清液進(jìn)行分析檢測。

2.1.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為 XBridge○RBEH C18柱（4.6mm×75mm，2.5μm）；流動相為0.1%甲酸水-乙腈，洗脫梯度為0.0～2.0 min，乙腈10%；2.0～7.5 min，乙腈90%；7.5～12 min，乙腈10%；柱溫為20℃；流速為350 μL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源 (ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)方式進(jìn)行負(fù)離子檢測，對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)，噴霧電壓 (IS):-4500 V，霧化溫度 (TEM):600℃，氣簾氣(CUR):30 psi，霧化氣 (GS1):85 psi，輔助氣(GS2):60 psi，碰撞氣 (CAD):Low；尼群地平[M-H]-母離子m/z:359.10，定量/定性碎片離子m/z:122.00/236.00；解簇電壓（DP）:-40V/-50 V，射入電壓（EP）:-5V/-5V，碰撞池入口電壓（CEP）:-15 V/-13 V，碎裂電壓 （CE）:-26V/-25 V，碰撞室射出電壓（CXP）:-2 V/-2 V；氘代尼群地平 [M-H]-母離子m/z:364.10，定量/定性碎片離子m/z:122.00/241.10；解簇電壓（DP）:-50V/-50 V，射入電壓 （EP）:-5V/-5 V，碰撞池入口電壓（CEP）:-15 V/-15 V，碎裂電壓 （CE）:-27 V/25 V，碰撞室射出電壓（CXP）:-2 V/-2 V。

2.2 溶液的配置

精密稱定尼群地平對照品5.84mg于10 mL棕色容量瓶，用乙腈溶解并定容稀釋成濃度分別為1.97、4.93、14.8、44.3、133、400ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液；同法精密稱定尼群地平對照品5.26mg和內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平對照品2.60 mg用乙腈分別稀釋成質(zhì)量濃度分別為 3.90、82.0、328ng·mL-1的質(zhì)控工作液和質(zhì)量濃度為2.08 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)沉淀劑。

2.3 分析方法的確證

2.3.1 特異性

測定空白血漿樣品、空白血漿加標(biāo)樣品及任一志愿者服藥后的未知濃度血漿樣品，由尼群地平、氘代尼群地平定量離子對（m/z359.10→m/z122.00、m/z 364.10→m/z122.00） 的提取離子流圖可知，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾尼群地平和內(nèi)標(biāo)的測定，方法的特異性良好。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

配制血藥質(zhì)量濃度為 0.197、0.493、1.48、4.43、13.3、40.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，進(jìn)樣檢測，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.284X+0.00962(r=0.9996)，結(jié)果表明，尼群地平血藥質(zhì)量濃度在0.197～40.0 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為 0.197 ng·mL-1。2.3.3 精密度與準(zhǔn)確度

處理定量下限、低、中、高4個質(zhì)量濃度（0.197、0.390、8.20、32.8 ng·mL-1）的血漿樣品各6份，連續(xù)3天，進(jìn)樣檢測，得批內(nèi)準(zhǔn)確度為88.32%～111.28%，批內(nèi)精密度為RSD%為1.75%～6.42%，批間準(zhǔn)確度為102.03%～106.15%，批間精密度為RSD%為2.83%～10.95%，符合生物樣本分析檢測要求。

2.3.4 提取回收率

配制質(zhì)量濃度分別為0.390、8.20、32.8 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品，每樣6份，與相應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液以水代替血漿同法配制的6份樣品比較，計算提取回收率，3個質(zhì)量濃度尼群地平的提取回收率分別為 （106.14±4.82）%，（103.93±3.22） %和 （101.53±4.50） %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為4.53%、3.10%和4.43%，平均提取回收率為103.89%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%為2.22%，回收對尼群地平及內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的影響較小，符合生物樣本分析檢測要求。

2.3.5 基質(zhì)效應(yīng)

圖1血漿中尼群地平和內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of nitrendipine（m/z359.10 →m/z122.00，1） and nitrendipine-d5（m/z 364.10 →m/z122.00，2） in plasma samples

處理低、中、高（0.390、8.20、32.8ng·mL-1）3個質(zhì)量濃度的尼群地平基質(zhì)樣品，每濃度各6份，與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品以水代替血漿照“血漿樣品的預(yù)處理”方法操作處理后的6份樣品進(jìn)樣比較，計算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)，尼群地平各質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)分別為（112.85±4.20） % ， （111.56±4.42） % 和 （111.84 ±4.23）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為3.72%、3.96%、3.78%，平均內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)為112.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%為0.61%，基質(zhì)對尼群地平及內(nèi)標(biāo)氘代尼群地平的影響較小，滿足生物樣品分析檢測要求。

2.3.6 穩(wěn)定性

取低、中、高3個質(zhì)量濃度（3.90、82.0、328ng·mL-1）的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)工作液各15份，室溫氮氣吹干，加入100 μL空白血漿，渦勻，分別考察室溫避光放置10 h和室溫不避光放置3 h及處理后放置7d的穩(wěn)定性。結(jié)果所有樣品相對偏差RE%在-10.37%～8.21%范圍內(nèi)，RSD%在1.23%～8.49%范圍內(nèi)，表明尼群地平血漿樣本在上述條件下均穩(wěn)定。

2.4 臨床試驗

試驗方案實施前經(jīng)倫理委員會審查批準(zhǔn)，16名健康志愿者體格檢查、心電圖檢查和實驗室檢查均正常。試驗前兩周至試驗結(jié)束未使用影響尼群地平片體內(nèi)過程或安全性評價的藥物或食物，自愿簽署知情同意書，采用自身交叉對照設(shè)計，將志愿者隨機(jī)分為空腹給藥組和餐后給藥組，空腹給藥組服藥前禁食10h，餐后給藥組服藥前禁食10h并于服藥前30 min內(nèi)進(jìn)食高脂高熱量餐，服藥劑量為10 mg，清洗期7天，服藥前（1 h內(nèi)） 及服藥后0.5 h、0.75 h、1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h采集靜脈血，所采血液在3000 r·min-1，2～8℃條件下離心10 min，然后分離血漿樣品，于-80℃冰箱中保存待測（全血采集和離心分裝等均在避光環(huán)境下進(jìn)行操作）。

圖2 志愿者空腹?fàn)顟B(tài) (A)和餐后狀態(tài) (B)下服用兩種制劑后平均血藥濃度-時間曲線 (n=8)Figure.2 Mean plasma concentration-time curves of oral administration of twopreparation under fasting (A)and fed (B)conditions in healthy volunteers(n=8)

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用DAS3.3.0軟件非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)，對藥動學(xué)參數(shù)AUC和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析和雙單側(cè)t檢驗，以AUC和Cmax的90%置信區(qū)間 (90%CI)評價尼群地平片的生物等效性。以多因素方差分析得到的殘差(mean square error，MSE)[7]，采用 DAS3.3.0 軟件計算尼群地平空腹服藥及餐后服藥Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的個體內(nèi)變異和個體間變異。

3 結(jié)果

3.1 藥-時曲線

志愿者餐后或空腹服用尼群地平參比制劑和受試制劑平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。

3.2 藥動學(xué)參數(shù)

采用DAS3.3.0軟件計算得到的藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

3.3 生物等效性評價

尼群地平片空腹?fàn)顟B(tài)或餐后狀態(tài)服藥后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 90%CI 結(jié)果見表 2。Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的 90%CI均超出 80%～ 125%，尼群地平兩制劑不符合生物等效性假設(shè)，餐后服藥藥動學(xué)參數(shù)AUC在個體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 受試者空腹及餐后狀態(tài)下經(jīng)口給予受試制劑與參比制劑后等效性統(tǒng)計檢驗Tab.2 Statistical test of bioequivalence after oral administration of test or reference preparation under fasting and high-fat diet conditions

（P＜0.05），空腹服藥藥動學(xué)參數(shù)Cmax在個體間、AUC在個體間及藥物間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。

空腹服用尼群地平片后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞個體內(nèi)變異為24.43%、22.87%、22.38%，個體間變異為39.71%、42.88%、43.84%；餐后服用尼群地平片后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞個體內(nèi)變異為64.20%、21.03%、23.06%，個體間變異為52.93%、57.60%、68.60%。

4 討論

藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC個體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與尼群地平藥物本身個體間變異有關(guān)[8]，空腹?fàn)顟B(tài)或餐后狀態(tài)服藥后藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC置信區(qū)間均超出80%～125%，兩個企業(yè)生產(chǎn)的尼群地平片生物不等效，說明受試制劑與原研藥仍存在一定差距，提示后續(xù)需要繼續(xù)優(yōu)化尼群地平片處方、改善制劑工藝，以期獲得等效性結(jié)果。