川麥冬多糖對免疫抑制烏骨雞公雛生長性能和免疫功能的影響

■陽 剛 楊仕群 徐 丹 任少均 舒 剛*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工工程系，四川宜賓 644003；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130）

川麥冬（Ophiopogon japonicus）為四川射洪地區(qū)大量種植的一種常見中藥，主要利用其干燥塊根，其性甘、微苦，微寒。潤肺清心、瀉熱生津、化痰止嘔、治嗽行水、潤腸通便等功效，主治肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究也表明，麥冬主要含沿階草苷、甾體皂苷、生物堿、谷甾醇、多糖、氨基酸、維生素等，具有抗疲勞、清除自由基、提高細胞免疫功能以及降血糖的作用。其中麥冬的主要有效成分川麥冬多糖在臨床上應(yīng)用于降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、抗過敏和平喘等[2]。目前，川麥冬多糖在地方品種烏骨雞生產(chǎn)中還沒有關(guān)于對免疫抑制應(yīng)用的報道，本試驗通過在肉雞飼料中添加川麥冬多糖，考察對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致烏骨雞公雛免疫抑制后生長性能和免疫功能的影響，為開發(fā)綠色的川麥冬多糖飼料添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用雞

1 d 出殼健康興文烏骨雞公雛300 只，由興文山地烏骨雞合作社提供。

1.2 藥品與試劑

川麥冬，購于成都市荷花池藥材批發(fā)市場。川麥冬多糖采用微波提取法：提取時間30 min，微波功率800 W，水與川麥冬液固質(zhì)量比65∶1，濾液經(jīng)活性碳脫色、Sevag法除蛋白、減壓濃縮后，加入無水乙醇使含醇量達80%，冰箱靜置過夜，過濾，沉淀用無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌數(shù)次，60 ℃烘干，即得到川麥冬多糖。

環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司提供)；生理鹽水為自行配制。新威靈（雞新城疫VG/GA 株活疫苗,由梅里亞動物保健有限公司提供）；新城疫抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清(哈爾濱獸醫(yī)研究所提供)；免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.3 主要儀器

AG 135電子天平(賽多利斯公司)，RE-2A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞東生化儀器廠)，G70D20CN1P-D2微波爐（廣州格蘭仕），DHW-9170A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(蘇州上醫(yī)用儀器廠)，752型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），AU2700 全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司產(chǎn)品)，移液槍等。

1.4 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗選擇1 d 健康烏骨雞公雛300 只，隨機分為3個日糧處理組，每個處理組5個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。對照組、環(huán)磷酰胺免疫抑制模型組飼喂基礎(chǔ)日糧，川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺免疫抑制組日糧由基礎(chǔ)日糧中添加1%的川麥冬多糖配制而成。飼養(yǎng)觀察5 d后，對照組胸肌注射0.5 ml 的生理鹽水，其余組將環(huán)磷酰胺按80 mg/kg 的劑量，生理鹽水稀釋到體積0.5 ml。采用胸肌注射的方法，連續(xù)注射3 d，整個試驗為期28 d。試驗前雞舍嚴(yán)格消毒，各組均采用單層籠養(yǎng)，各組自由采食和飲水，舍內(nèi)溫度、濕度及光照等按照烏骨雞管理方法進行，3 d 時新城疫疫苗點眼滴鼻接種。

1.5 基礎(chǔ)日糧

基礎(chǔ)日糧按NRC(1994)推薦的肉仔雞營養(yǎng)需要配制的玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.6 測定指標(biāo)及測定方法

1.6.1 生長性能指標(biāo)

試驗期間各試驗組詳細記錄采食、死亡等情況，同時在14、28 d的早上08:00空腹稱雛雞的體質(zhì)量，計算出平均日增重、平均日采食量和料重比等。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.6.2 免疫器官指數(shù)測定

14、28 d 時，每個重復(fù)隨機抽取4 只雞稱空腹體質(zhì)量，頸部放血致死后摘取脾、胸腺及法氏囊，準(zhǔn)確稱出質(zhì)量，計算各免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(g/kg)=器官質(zhì)量/活體質(zhì)量

1.6.3 新城疫抗體滴度

血清新城疫抗體滴度采用微量血球血凝抑制(HI)試驗法測定，參照GB/T 16550-2008的方法進行。

1.6.4 血清免疫球蛋白測定

免疫球蛋白(IgG、IgM 及IgA)濃度：血清IgA、IgG及IgM 濃度采用免疫比濁法(Im-munoturbidimetry，ITM)測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 軟件整理，SPSS 17.0 軟件One-Way ANOVA 進行方差分析，用Duncan's 法進行多重比較，試驗數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 川麥冬多糖對免疫抑制公雛精神狀態(tài)和生長性能的影響（見表2）

對各組雞進行觀察并稱重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組雞生長最好，羽毛緊湊，精神狀態(tài)好，喜歡運動。而環(huán)磷酰胺組雞生長較差，體輕羽毛零亂，精神萎靡，由此可見免疫抑制模型構(gòu)建成功。從表2看出，1～14 d時，環(huán)磷酰胺組平均日增重顯著低于對照組（P＜0.05），環(huán)磷酰胺組與川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組的平均日采食量低于對照組，但料重比皆高于對照組，但各組差異不顯著（P＞0.05）。在15～28 d時，環(huán)磷酰胺組平均日增重與平均日采食量均顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺組的料重比顯著高于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）。0～28 d時，各組比較，環(huán)磷酰胺組平均日增重與平均日采食量均顯著低于對照組（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺組的料重比顯著高于對照組（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺組的存活率也顯著低于對照組（P＜0.05）。川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組各指標(biāo)優(yōu)于環(huán)磷酰胺組，接近對照組，但均無顯著性差異（P＞0.05）。試驗結(jié)果表明環(huán)磷酰胺導(dǎo)致雛雞生長出現(xiàn)抑制，而川麥多糖能解除抑制。

表2 川麥冬多糖對免疫抑制公雛生長性能的影響

2.2 川麥冬多糖對免疫抑制公雛免疫器官指數(shù)的影響（見表3）

由表3 可知，在14、28 d 時，各組胸腺指數(shù)比較，環(huán)磷酰胺組最低，但與對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組無顯著性差異（P＞0.05）。各組脾指數(shù)比較，14 d時，環(huán)磷酰胺組最低，顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；28 d 時，環(huán)磷酰胺組顯著低于對照組（P＜0.05），但與川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組無顯著性差異（P＞0.05）。法氏囊指數(shù)比較，14 d時環(huán)磷酰胺組最低，顯著低于川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；28 d 時環(huán)磷酰胺組顯著低于對照組（P＜0.05），但與川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組無顯著性差異（P＞0.05）。由此可見，環(huán)磷酰胺按照劑量80 mg/kg 給予雛雞，主要導(dǎo)致脾臟和法氏囊的生長受到抑制，對胸腺的生長影響較小，但川麥冬多糖可解除環(huán)磷酰胺對免疫器官發(fā)育的抑制。

表3 各組免疫器官指數(shù)比較(n=20)

2.3 川麥冬多糖對免疫抑制公雛新城疫抗體滴度的影響（見表4）

表4 各組對新城疫抗體滴度的檢查結(jié)果(n=20,nlog2)

從表4可知，14、28 d時環(huán)磷酰胺組都最低，顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）。由此可見環(huán)磷酰胺影響雛雞對疫苗抗體的生成，加入川麥冬多糖可以讓新城疫抗體滴度恢復(fù)到接近正常的水平。

2.4 川麥冬多糖對免疫抑制公雛免疫球蛋白的影響（見表5）

表5 各組免疫球蛋白的檢測結(jié)果(g/l)

由表5可知，IgA濃度在14 d時，環(huán)磷酰胺組顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；IgA濃度在28 d 時，環(huán)磷酰胺組顯著低于對照組（P＜0.05），與川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組差異不顯著（P＞0.05）。IgG 濃度比較，14、28 d 時環(huán)磷酰胺組皆顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）。IgM 濃度比較，14 d 環(huán)磷酰胺組皆顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；28 d時，各組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 川麥冬多糖對免疫抑制公雛精神狀態(tài)與生長性能的影響

環(huán)磷酰胺在臨床上主要用來治療腫瘤，但其副反應(yīng)能抑制骨髓和導(dǎo)致機體免疫功能低下，很多免疫抑制模型就通過注射其來制備[3]。董曉芳等[4]對肉雞采用1次性腹腔注射環(huán)磷酰胺[10 mg/(kg·BW)]的方法成功制備了肉雞免疫模型。本試驗中采用環(huán)磷酰胺注射公雛后，雛雞的興奮性降低，食欲下降，體重下降，而川麥冬多糖可以對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的抑制得到解除。從生長性能數(shù)據(jù)可以看出，環(huán)磷酰胺組1～14 d時，平均日增重顯著低于對照組；15～28 d 時，環(huán)磷酰胺組生長性能顯著低于對照組和川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組；川麥冬多糖+環(huán)磷酰胺組生長性能接近對照組。馮焱等[5]報道都指出給雞注射不同劑量的環(huán)磷酰胺可顯著抑制雞體質(zhì)量的增加，且與劑量呈依賴關(guān)系。趙謹(jǐn)[6]的研究表明環(huán)磷酰胺使雛雞采食量、日增重顯著降低（P＜0.05），料重比顯著升高（P＜0.05）。環(huán)磷酰胺對大鼠、豬都能抑制生長[7-8]。黃精粗多糖、黃芪多糖、復(fù)合多糖、桑黃多糖等對雞、鼠都能解除環(huán)磷酰胺對其生長的抑制[9-11]。

3.2 川麥冬多糖對免疫抑制公雛免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、脾和法氏囊是雞的主要免疫器官，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)可以評價雞的免疫狀態(tài)。環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑，可抑制機體免疫功能[12]。環(huán)磷酰胺可顯著降低雞早期脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)，對胸腺指數(shù)的影響效果不顯著[5]。有研究表明麥冬多糖對小鼠胸腺和脾臟重量有明顯增加作用，具有促使T 淋巴細胞和B 淋巴細胞增殖的作用[13]。韓鳳梅等[14]證實山麥冬多糖對環(huán)磷酰胺造成的小鼠免疫器官損傷有一定的恢復(fù)作用，能顯著增強免疫低下小鼠的胸腺和脾臟質(zhì)量，還能升高注射環(huán)磷酰胺小鼠外周血的白細胞數(shù)。本試驗結(jié)果也表明，環(huán)磷酰胺注射雛雞后能導(dǎo)致14 d時的脾臟、法氏囊指數(shù)下降，28 d時，與對照組同樣差異顯著（P＜0.05），但與川麥多糖+環(huán)磷酰胺組差異不顯著（P＞0.05）；川麥多糖可以改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫抑制狀態(tài)，讓脾臟、法氏囊指數(shù)恢復(fù)到正常水平。環(huán)磷酰胺也降低胸腺指數(shù)，但與對照組未達到顯著水平。

3.3 川麥冬多糖對免疫抑制公雛新城疫抗體滴度的影響

新城疫抗體滴度是反映雛雞體內(nèi)對新城疫病毒的特異性應(yīng)答，抗體越高說明機體的體液免疫功能越強。環(huán)磷酰胺不僅能造成細胞免疫抑制, 還可造成體液免疫抑制。它對體液的抑制作用比較明顯, 且持續(xù)時間較長。本試驗證實，單用環(huán)磷酰胺能導(dǎo)致雛雞新城疫抗體下降明顯，顯著低于對照組、川麥多糖+環(huán)磷酰胺組；與免疫器官指數(shù)降低相對應(yīng)。研究表明，多糖對體液免疫功能是具有促進作用的[15]。例如有黃芪多糖能解除環(huán)磷酰胺導(dǎo)致肉雞抗體下降的報道[16]。

3.4 川麥冬多糖對免疫抑制公雛免疫球蛋白的影響

血清中IgA、IgG和IgM 3 種免疫球蛋白在血清中的含量高低是判斷動物體液免疫功能的重要指標(biāo)之一。環(huán)磷酰胺導(dǎo)致雛雞血清中的3 種免疫球蛋白顯著降低（P＜0.05），IgM 在28 d 時才逐漸恢復(fù)到正常水平。而文獻報道麥冬多糖能顯著提高運動訓(xùn)練大鼠外周血WBC和LC數(shù)量,增加CD4+百分比、CD4+/CD8+,提高血清的IgA、IgM、IgG含量[17]。本試驗也證實了川麥冬多糖可以逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺對雛雞免疫球蛋白生成的抑制，達到正常的水平。這些試驗結(jié)果進一步驗證了川麥冬多糖對體液免疫功能的促進效果。

綜上所述，川麥冬多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，能使環(huán)磷酰胺造成的雛雞免疫抑制狀態(tài)恢復(fù)到正常水平。