經(jīng)支氣管鏡針吸活檢聯(lián)合多標(biāo)志物檢測(cè)在肺癌病理分型中的應(yīng)用價(jià)值

陳菁，劉旭，楊碩，羅光偉

（武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430022）

肺癌在男性惡性腫瘤中位居發(fā)病率和死亡率第一位，在女性中其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)［1］。近年來(lái)雖然肺癌治療取得了較大進(jìn)展，但仍存在早期診斷困難、治療效果差等問(wèn)題，仍是病死率最高的腫瘤。世界衛(wèi)生組織將肺癌分為4種主要病理類型，分別為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。前三者通常統(tǒng)稱為非小細(xì)胞肺癌，占所有肺癌的85%，是威脅肺癌患者生存的主要組織類型，其中又以腺癌和鱗狀細(xì)胞癌常見。不同類型的肺癌治療手段差別顯著，因此對(duì)肺癌進(jìn)行正確的組織學(xué)和分子病理學(xué)分型是獲得正確治療的重要前提［2-3］。

經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù) （transbronchial needle aspiration，TBNA） 或支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下的TBNA是一種新型肺癌診斷手段，其對(duì)肺癌診斷的敏感度達(dá)90%，特異度達(dá)100%。與PET-CT相比，TBNA具有更高的敏感度和特異度，已被寫入2011年國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)的肺癌診治指南［4］。對(duì)TBNA獲得的標(biāo)本一般進(jìn)行基于形態(tài)學(xué)的HE染色，判斷腫瘤的發(fā)生，但進(jìn)一步判定病理分型則存在諸多限制，如細(xì)胞量少、分化程度低等。對(duì)肺癌病理組織標(biāo)本進(jìn)行分子病理學(xué)檢測(cè)，根據(jù)已知公認(rèn)的分型標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確地做出病理分型診斷。研究［5-6］顯示，肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌幾乎不重疊共表達(dá)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 （thyroid transcription factor-1，TTF-1） 和p63；細(xì)胞角蛋白 （cytokeratin，CK）5和CK6是鱗狀細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物［7］；CK7是腺癌的特異性標(biāo)志物［8］。目前上述指標(biāo)相關(guān)檢測(cè)常在術(shù)后切除病理組織上進(jìn)行，不利于早期制定治療方案，亦不適用于不宜手術(shù)的患者。因此，若能結(jié)合應(yīng)用TBNA與病理分型分子標(biāo)志物檢測(cè)，則能很好解決2種診斷方法的不足。

本研究回顧性研究了TBNA獲得的肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌患者病理組織標(biāo)本，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TTF-1、p63、CK5、CK7等標(biāo)志物的表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)各指標(biāo)診斷肺癌病理分型的價(jià)值和準(zhǔn)確性，并探究聯(lián)合應(yīng)用4種標(biāo)志物進(jìn)行綜合診斷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例樣本

回顧性選取2015年7月至2016年12月間術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為肺癌的患者178例，其中男143例，女35例，平均年齡53.2 （35～77） 歲；組織學(xué)類型：鱗狀細(xì)胞癌120例，腺癌58例。

1.2 組織樣本的獲得及總RNA的提取

首先經(jīng)增強(qiáng)CT掃描等影像學(xué)檢查，或在超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下，獲得病變部位的準(zhǔn)確定位信息。在支氣管鏡輔助下進(jìn)行TBNA操作，利用特制的帶有可彎曲導(dǎo)管的穿刺針 （專利號(hào)201720265388.7），通過(guò)氣管鏡的活檢通道進(jìn)入氣管內(nèi)，對(duì)縱隔內(nèi)腫大的淋巴結(jié)或腫塊進(jìn)行穿刺，負(fù)壓抽吸獲取細(xì)胞及組織樣本。在送檢病理科后，留取剩余樣本收集于細(xì)胞凍存管中，盡快放入液氮中保存待用。

待病理組織樣本收集齊備，選取目標(biāo)病理組織進(jìn)行常規(guī)TRIZOL （美國(guó)Invitrogen公司） 提取RNA操作，并經(jīng)紫外分光光度法定量，統(tǒng)一各病例RNA樣本濃度后，進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TTF-1、p63、CK7、CK5的表達(dá)水平

取上述提取的定量后總RNA，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （美國(guó)Invitrogen公司） 的作用下，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以該cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。目的基因的引物序列：TTF-1，正義5’-CGTTCTCAG TGTCTGACATCTTGA-3’，反義5’-CCTCCATGCCCA CTTTCTTG-3’；p63，正義5’-GGAAAACAATGCCCA GACTC-3’，反義5’-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3’；CK7，正義5’-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3’，反義5’-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3’；CK5，正義5’-A TCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3’，反義5’-AAACACTGCTTGTGACAACAGAG-3’；GAPDH，正 義5’-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3’，反 義5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各標(biāo)志物基因表達(dá)水平用±s表示；基因表達(dá)水平組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；基因表達(dá)水平與病理分型的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；變量對(duì)病理分型的診斷價(jià)值采用受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線法進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌病理分型分子標(biāo)志物表達(dá)水平

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TTF-1、p63、CK7、CK5的表達(dá)水平。腺癌中各分子標(biāo)志物的表達(dá)水平：TTF-1為1.732±0.243，p63為0.110±0.003，CK7為1.221±0.141，CK5為0.215±0.030；鱗狀細(xì)胞癌中各分子標(biāo)志物的表達(dá)水平：TF-1為0.107±0.004，p63為1.676±0.220，CK7為0.105±0.012，CK5為1.533±0.102。與腺癌相比，鱗狀細(xì)胞癌中TTF-1 （P = 0.006）、CK7 （P = 0.012） 的表達(dá)水平顯著降低，p63 （P = 0.008）、CK5 （P = 0.025）的表達(dá)水平顯著升高。

2.2 建立多因素綜合評(píng)分（total score，TS）診斷模型

采用Pearson相關(guān)分析確定各分子標(biāo)志物基因表達(dá)水平與分型的相關(guān)性 （表1）。基于各基因表達(dá)水平與肺癌病理分型的相關(guān)系數(shù) （r），建立TS診斷模型：TS=-0.672×TTF-1+0.778×p63-0.583×CK7+0.604×CK5，TS值越大則病理分型越傾向于鱗狀細(xì)胞癌，TS值越小則病理分型越傾向于腺癌。

2.3 ROC曲線分析各指標(biāo)診斷肺癌病理分型的價(jià)值

采用ROC曲線分析4種分型標(biāo)志物與綜合指標(biāo)TS對(duì)肺癌病理分型的診斷價(jià)值 （圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTF-1、p63、CK7、CK5表達(dá)水平診斷肺癌分型均有良好價(jià)值，但運(yùn)用4個(gè)指標(biāo)獲得的綜合指標(biāo)TS進(jìn)行病理分型診斷時(shí)，則最佳分界值的靈敏度 （0.942）和特異度 （0.841） 均最高，ROC曲線下面積亦最大（0.934），診斷價(jià)值最佳。

表1 分型標(biāo)志物表達(dá)水平與肺癌病理分型的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation between the expression of typing markers and the pathological typing of lung cancer

2.4 單因素和多因素診斷肺癌病理分型的準(zhǔn)確性比較

圖1 ROC曲線分析各指標(biāo)單獨(dú)及綜合應(yīng)用判定肺癌病理分型的價(jià)值Fig.1 Diagnostic value of each marker alone or in combination for the pathological typing of lung cancer，as determined by ROC curve analysis

分析4種分型標(biāo)志物及綜合指標(biāo)TS對(duì)肺癌病理分型的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺癌檢出率最高的單因素指標(biāo)為TTF-1 （45/88），鱗狀細(xì)胞癌檢出率最高的單因素指標(biāo)為p63 （94/120），總檢出率最高的單因素指標(biāo)為p63 （76.4%）。采用χ2檢驗(yàn)比較單一指標(biāo)與綜合指標(biāo)檢出率的情況，TS的腺癌檢出率 （P =0.040）、鱗狀細(xì)胞癌檢出率 （P = 0.013） 及總檢出率（P < 0.001） 均顯著升高。見表2。

3 討論

大部分肺癌患者在診斷時(shí)已無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)，需要全身化療。越來(lái)越多的證據(jù)表明，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌治療反應(yīng)明顯不同，這就推動(dòng)了非小細(xì)胞肺癌精確的病理分型。如貝伐單抗禁用于鱗狀細(xì)胞癌，這種藥物增加鱗狀細(xì)胞癌患者的肺出血風(fēng)險(xiǎn)［9］。因此，肺癌分型已經(jīng)成為治療的關(guān)鍵，并能夠指導(dǎo)個(gè)性化治療。對(duì)于無(wú)法獲得手術(shù)切除標(biāo)本的患者，通過(guò)TBNA獲取病理組織則是解決病理分型問(wèn)題的重要手段。而如何充分利用TBNA獲取的小標(biāo)本進(jìn)行分型診斷，則具有重要臨床意義。

表2 不同分型指標(biāo)進(jìn)行肺癌病理分型的檢出率比較Tab.2 Comparison of the accuracy of pathological typing of lung cancer with different markers

本研究選擇了TTF-1、p63、CK7、CK5等肺癌分型常見標(biāo)志物，通過(guò)敏感度高、對(duì)樣本量要求小的實(shí)時(shí)PCR法［10］進(jìn)行檢測(cè)，考察單因素和多因素診斷腺癌或者鱗狀細(xì)胞癌的價(jià)值。TTF-1是診斷肺腺癌敏感度較高的檢測(cè)因子，盡管在其他腫瘤也有表達(dá)，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，但是都沒有在肺腺癌中表達(dá)顯著。p63是p53家族的新成員，與多種復(fù)層上皮原發(fā)性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在肺癌中主要在鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)呈陽(yáng)性。CK是細(xì)胞骨架的成份之一，其中相對(duì)分子量較高的CK5、CK6主要表達(dá)在鱗狀上皮細(xì)胞及其腫瘤組織中，而相對(duì)分子量低的CK7則表達(dá)在腺上皮細(xì)胞及其腫瘤組織中。

與已有研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中TTF-1、CK7表達(dá)水平顯著增高，肺鱗癌組織中p63、CK5表達(dá)水平顯著增高。本研究應(yīng)用Pe arson相關(guān)性分析，確立了各指標(biāo)與肺癌分型的相關(guān)系數(shù)，建立綜合4種標(biāo)志物的多因素綜合評(píng)分診斷模型TS。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于單因素診斷效果，多因素的TS具有更高的靈敏度和特異度。并且在對(duì)比診斷病理分型的準(zhǔn)確性時(shí)，TS結(jié)果最好，總體檢出率達(dá)到90.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各個(gè)單因素的診斷準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，利用TBNA獲取肺癌患者病理組織，并基于實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行肺癌分型重要分子標(biāo)志物TTF-1、p63、CK7、CK5等的表達(dá)水平檢測(cè)，是可行的病理診斷方法。且綜合運(yùn)用各分型指標(biāo)進(jìn)行診斷能夠獲得更高的診斷效率，這為肺癌病理分型診斷提供了新的檢測(cè)思路。