紅芪復(fù)方對CCl4致小鼠肝損傷防治作用的篩方研究

楊亞飛,楊秀艷,薛志遠(yuǎn),方瑤瑤,周湘琳,趙良功，封士蘭*

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730000)

舒肝消積丸是國醫(yī)名師周信有的臨床經(jīng)驗方，對乙型肝炎具有顯著療效[1]，同時能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[2]、抗肝損傷和促進(jìn)肝損傷的修復(fù)[3]。在舒肝消積丸的處方配比基礎(chǔ)上，總結(jié)了4個紅芪復(fù)方經(jīng)驗方，紅芪為主藥，由紅芪、丹參、郁金、柴胡、當(dāng)歸、莪術(shù)、茵陳、板藍(lán)根、五味子和女貞子等中藥組成。紅芪(RadixHedysari)也稱為獨根，為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，是甘肅道地藥材。本實驗選取4個紅芪復(fù)方經(jīng)驗方，用四氯化碳(CCl4)致小鼠肝損傷，篩選對肝損傷防治效果最佳的紅芪復(fù)方。

1 儀器與材料

1.1儀器 KQ3200DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)；FA2104 電子天平(上海市安亭電子儀器廠)；550酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad 公司)；UV-1700 紫外分光檢測儀(日本島津公司)；DP73顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)

1.2試藥 聯(lián)苯雙酯滴丸(萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司，批號20151019，規(guī)格：1.5 mg·粒-1)。所有藥材均購于蘭州惠仁堂大藥房，經(jīng)蘭州大學(xué)生藥學(xué)研究所馬志剛教授鑒定為正品。4個紅芪復(fù)方的組成分別為：紅芪復(fù)方一:紅芪、丹參、郁金和柴胡；紅芪復(fù)方二:紅芪、丹參、郁金、柴胡和五味子；紅芪復(fù)方三：紅芪、茵陳、丹參、女貞子和莪術(shù)；紅芪復(fù)方四：紅芪、丹參、當(dāng)歸、板藍(lán)根和五味子。各復(fù)方分別加入藥材總量的8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮得浸膏。四氯化碳(CCl4，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；花生油(山東魯花集團(tuán)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(批號20170421)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號20170425)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號20170425)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20170424)和丙二醛(MDA)試劑盒(批號20170424)，蘇木素-伊紅(HE)染液(批號20170425)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量為20±2 g，合格證號：SCXK(甘)-20130002，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。

2 方法

2.1動物分組及給藥 取雄性昆明種小鼠84 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組和4個紅芪復(fù)方組，每組12 只。模型組按照10 mL·kg-1皮下注射CCl4-花生油溶液(2∶8) 造小鼠肝損傷模型，每周1次，連續(xù)7周，形成肝損傷。除空白組外，各組均按照模型組同法造模。造模同時，陽性對照組每天灌胃聯(lián)苯雙酯滴丸(100 mg·kg-1)，4個給藥組每天給予紅芪復(fù)方(原藥材20 g·kg-1)灌胃，空白組和模型組每天給予生理鹽水，劑量為10 mL·kg-1，連續(xù)7周。末次給藥后禁食24 h，摘眼球，取血，以3 000 r·min-1離心，靜置10 min，分離出血清。采血后處死小鼠，取部分肝左葉，置于3.6 mol·L-1甲醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液)中固定，剩余肝左葉置于凍存管中，在-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2檢測指標(biāo)和檢測方法

2.2.1血清ALT和AST的活性測定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行測定。

2.2.2肝組織SOD 活力及 MDA 含量的測定 取一部分肝臟組織，用生理鹽水制成質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的肝組織勻漿，按照試劑盒說明書方法操作，檢測肝組織中蛋白質(zhì)含量、SOD的活力和MDA 的含量。

2.2.3肝組織病理學(xué)觀察 多聚甲醛固定后的肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，用HE染色，觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.3數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，說明CCl4造模會降低小鼠體質(zhì)量。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復(fù)方組小鼠體質(zhì)量變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明本實驗條件下陽性對照組和紅芪復(fù)方各組對小鼠的體質(zhì)量無明顯影響。見表1。

3.2對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)，說明CCl4造模會升高小鼠肝臟指數(shù)。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復(fù)方組小鼠肝臟指數(shù)變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明本實驗條件下陽性對照組和紅芪復(fù)方各組對小鼠的肝臟指數(shù)無明顯影響。見表1。

3.3對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠 ALT和AST含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清 ALT和AST 水平明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的模型建立成功;與模型組比較，陽性對照組和紅芪復(fù)方各組ALT和AST水平明顯降低(P<0.05)。與陽性對照組比較，紅芪復(fù)方三組ALT差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且更能降低ALT水平，AST水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明紅芪復(fù)方三組效果最佳。見表2。

表1 紅芪復(fù)方對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

組別劑量/g·kg-1體質(zhì)量/g肝質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/mg·g-1空白組37.98±3.801.31±0.2234.51±4.07模型組31.89±6.78?1.87±0.56?58.12±10.10?陽性對照組0.133.28±5.142.04±0.4561.01±8.91紅芪復(fù)方一組2033.31±5.421.97±0.2959.77±7.13紅芪復(fù)方二組2034.78±4.852.11±0.2861.01±4.34紅芪復(fù)方三組2033.99±3.962.10±0.3162.11±8.37紅芪復(fù)方四組2035.80±5.622.12±0.3159.87±7.37

注:與空白組比較*P<0.05。

表2 紅芪復(fù)方對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響

組別劑量/g·kg-1ALT水平/U·L-1AST水平/U·L-1空白組37.33±11.06117.34±19.39模型組152.42±16.55?270.58±21.41?陽性對照組0.180.05±11.68#158.19±21.64#紅芪復(fù)方一組2099.28±15.22#△189.10±16.27#△紅芪復(fù)方二組2067.55±12.48#△204.73±16.67#△紅芪復(fù)方三組2058.05±10.59#△162.42±18.06#紅芪復(fù)方四組20125.05±9.30#△220.57±17.90#△

注:與空白組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與陽性對照組比較△P<0.05。

3.4對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織勻漿SOD和MDA的影響 與空白組比較，模型組肝組織SOD 活性明顯降低(P<0.05)，小鼠肝組織的 MDA 含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復(fù)方組均能明顯升高SOD活性(P<0.05)以及降低肝組織MDA含量。與陽性對照組比較，紅芪復(fù)方三組SOD 和MDA差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明紅芪復(fù)方三組與陽性對照組效果無差異。見表3。

表3 紅芪復(fù)方對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織勻漿SOD和MDA的影響

組別劑量/g·kg-1SOD水平/U·mgprot-1MDA水平/nmol·mgprot-1空白組181.91±30.131.48±0.63模型組123.15±31.90?3.26±1.20?陽性對照組0.1220.39±41.89#2.43±0.73#紅芪復(fù)方一組20269.11±43.41#△1.80±0.95#紅芪復(fù)方二組20242.18±48.11#2.08±1.08#紅芪復(fù)方三組20203.06±41.15#2.21±0.73#紅芪復(fù)方四組20206.00±35.30#2.39±0.55#

注:與空白組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05;與陽性對照組比較△P<0.05。

3.5對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 肝組織切片經(jīng)HE 染色后，在光鏡下觀察，空白組小鼠肝組織清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀排列，匯管區(qū)清楚。模型組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生空泡樣變，水腫嚴(yán)重，脂肪變性，排列不規(guī)整，可見少量灶狀壞死，是典型的肝損傷病理特征，說明CCl4造模成功。與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復(fù)方組細(xì)胞腫脹范圍、變性程度和肝組織壞死區(qū)域等病理性損傷均有不同程度的減輕，以紅芪復(fù)方三組損傷程度最低，與生化指標(biāo)測定結(jié)果一致。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色病理切片(10×20)

A.空白組;B.模型組;C.陽性對照組;D.紅芪復(fù)方一組;E.紅芪復(fù)方二組；F.紅芪復(fù)方三組；G.紅芪復(fù)方四組。

Fig.1 HE staining pathological sections of liver of mice in each group (10×20)

A.normal control group;B.model group;C.positive control group；D.the traditional Chinese medicine prescription 1 ofRadixHedysarigroup；E.the traditional Chinese medicine prescription-2 ofRadixHedysarigroup；F.the traditional Chinese medicine prescription-3 ofRadixHedysarigroup；G.the traditional Chinese medicine prescription-4 ofRadixHedysarigroup.

4 討論

肝損傷是指在理化因素作用下，肝細(xì)胞發(fā)生腫脹、變性、壞死和凋亡等不同程度的病變，是多種肝臟疾病共有的病理狀態(tài)[4-5]。本研究采用的CCl4致化學(xué)性肝損傷小鼠模型是目前使用最為廣泛的肝損傷動物模型[6-8]。

研究證實，CCl4誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制是CCl4被肝微粒體細(xì)胞色素P450 代謝活化，產(chǎn)生·CCl3、CCl3OO·等一系列自由基[9]，過量的自由基進(jìn)而引起肝微粒體細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，使肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性遭到破壞，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死[10-11]。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，膜通透性改變，使可溶性酶ALT和AST由細(xì)胞內(nèi)滲漏進(jìn)入血循環(huán)，引起血清中ALT和AST水平升高[12]。由此可見，ALT和AST的含量變化能在一定程度上反映肝細(xì)胞的受損程度[13]。SOD是清除體內(nèi)自由基、抑制自由基反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[14]，其活性降低會導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基增多，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能受到損傷。SOD在體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡中至關(guān)重要，可對損傷起到一定的緩解作用。而MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可與體內(nèi)的生物大分子結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死。因此，SOD 活性和MDA 含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映體內(nèi)組織和細(xì)胞損傷程度[15-17]。

研究結(jié)果顯示，肝損傷小鼠血清ALT和AST含量明顯升高，反映CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的肝功能受損；而肝組織勻漿SOD 活性降低，MDA含量增高則反映脂質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)；HE染色的肝組織切片可較直觀地反映肝組織病理損傷的程度，與模型組比較，陽性對照組和各紅芪復(fù)方給藥組肝組織壞死區(qū)域變小，細(xì)胞腫脹、變性等病理性損傷均有不同程度的減輕。

紅芪性甘，微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血和行滯通痹等功效[18]。丹參、郁金、當(dāng)歸和莪術(shù)歸肝經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)肝、調(diào)達(dá)肝氣及活血祛瘀的功效。茵陳、板藍(lán)根和柴胡能消熱利濕、利膽退黃。五味子和女貞子為扶益補(bǔ)虛之品，能補(bǔ)益肝腎。紅芪復(fù)方各組均可明顯降低CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平，增強(qiáng)肝組織SOD活性，降低MDA含量，同時還可明顯減輕肝組織病變損傷程度。紅芪復(fù)方三(紅芪、茵陳、丹參、女貞子和莪術(shù))效果最佳，具有進(jìn)一步研究價值。