二乙基亞硝胺誘導的肝癌模型大鼠尿液代謝組學研究

米熱阿依·亞力昆，迪那拉·恰熱甫汗，阿合爾扎馬尼·麥麥提，巴哈古力·阿卜都熱合曼，太力艾提·吐爾洪，巴吐爾·買買提明

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學維吾爾醫(yī)學院，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，烏魯木齊 830011)

肝細胞性肝癌簡稱肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC),近20 年病死率逐年升高[1-2]。肝癌發(fā)病率高、死亡率高，預后極差，在癌癥相關死亡率中位居第3位。數(shù)據(jù)顯示，80%的肝癌患者由肝硬化轉化而來，乙肝、丙肝、酗酒、黃曲霉素和化學致癌劑的接觸是其發(fā)病的主要原因[3-4]。其中化學致癌劑引起的肝癌占一定比例，而亞硝胺類誘導劑二乙基亞硝胺溶液(DEN)致癌率較高，是建立肝癌模型中常用的化學誘導劑[5-7]。DEN誘導肝癌的動物模型與臨床患者的組織學和遺傳學特征相似，此方法在肝癌模仿過程中較常用[8]。

代謝組學是研究體內代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)生物學方法，能為疾病狀態(tài)、藥理毒理和基因功能的研究提供大量信息[9-10]。目前，有研究利用代謝組學尋找肝癌的潛在生物標志物，在肝癌的研究領域取得了成果[11]。

本研究采用DEN誘導大鼠肝癌模型，采用核磁共振波譜技術(1H-NMR)分析模型大鼠尿液中的小分子代謝物，闡述由DEN導致的體內代謝變化機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 Inova 600 MHz型核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；5 mm 核磁管(美國威爾瑪公司)。

1.2試藥 DEN(美國Sigma公司)；2，2-二甲基-2-硅雜戊烷-5-磺酸鈉(DSS)緩沖液(武漢安隆科訊公司)；超純水，Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3動物 選擇SPF級健康SD雄性大鼠，體質量180±20 g，隨機分為2組，即正常對照組(n=10)與肝癌模型組(n=9)，適應性飼養(yǎng)3 d。實驗動物由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：[SCXK (新) 2011-0004]。所有動物實驗程序均符合倫理學相關規(guī)定。

2 方法

2.1動物模型的制備 正常對照組大鼠按需飲用滅菌水，肝癌模型組大鼠按需飲用質量濃度為0.1 mg·mL-1的DEN溶液造大鼠肝癌模型。連續(xù)飲用18周，每周稱定1次質量，2組大鼠建模周期完成后的最后1天禁食但自由飲水，采集24 h尿樣，麻醉，取肝臟，置于多聚甲醛溶液中。

2.2動物肝臟病理切片 將肝臟樣本用40 g·L-1的通用型多聚甲醛固定；依次用體積分數(shù)為70%，80%和100%的乙醇梯度洗脫，二甲苯透明，組織塊浸蠟和包埋，將包埋好的組織切片，HE染色，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)學改變。

2.3尿液核磁共振檢測 將尿液樣品以12 000 r·min-1離心10 min，取450 μL上清液，加入DSS緩沖液50 μL至5 mm核磁管中，采用Inova 600型核磁共振波譜儀調用NOESYPRESAT1D脈沖序列進行核磁共振氫譜的測定。水峰采用飽和時間為2 s的預飽和方式壓制，參數(shù)設置為采樣點數(shù)：32 k，譜寬：10 000 Hz，掃描次數(shù)：128次，測試時間：1.64 s，測試溫度：25 ℃。為識別和鑒定圖譜中的峰，對部分樣本進行了核磁共振二維譜檢測，包括質子全相關譜(Total correlation spectroscopy，TOCSY)，H-H同核相關譜(1H-1H Homonuclear correlation spectroscopy，1H-1H COSY)和J-分解譜(J-resolved spectroscopic，J-RES)等。

2.4圖譜處理和統(tǒng)計學分析 對所有核磁共振氫譜進行相位及基線調整，并用指數(shù)窗函數(shù)進行處理，其增寬因子為0.5 Hz。DSS緩沖液作為內標，其化學位移定為0 ppm?；瘜W位移在0～10 ppm范圍內將圖譜分成3 367段進行自動積分，每段為0.003 ppm；因尿液中的水信號對分析結果有干擾，因此除去δH=4.95～4.70 ppm范圍的水峰信號。剩余的信號積分值進行歸一化，采用SIMCA-P軟件對數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)，PLS模型(偏最小二乘法)的外部驗證采用200次的排列驗證試驗，以便判斷分析模型的有效性。代謝物在2組中的差異性采用OPLS-DA分析中的VIP值來判斷，將沒有采用的r值刪除。差異性代謝物參與的代謝通路采用MetaboAnalyst 3.0進行分析，影響因子(pathway impact)>0.1和-log(p)>3的代謝通路被認為是2組中差異明顯的代謝通路。

3 結果

3.1組織病理診斷結果 大鼠肝臟組織病理診斷結果見圖1。由圖1可知，正常對照組大鼠肝小葉結構完整，細胞排列成索狀，肝細胞胞漿紅染，細胞核多位于中央，肝血竇見少量紅細胞，門管區(qū)小葉間動靜脈及結構完整；肝癌組大鼠肝小葉結構不完整，肝細胞排列呈巢狀，血管多，部分區(qū)域見癌性壞死，癌細胞有明顯異型性，大小不一。

圖1 大鼠肝臟病理切片圖

A.肝癌模型組；B.正常對照組。

Fig.1 Liver pathological sections of rats

A.hepatocellular carcinoma model group；B.normal control group.

3.2大鼠體質量變化 見圖2。由圖2可知，隨著模型建立時間的延長，2組大鼠體質量差距逐步擴大，肝癌組大鼠體質量明顯低于正常對照組(P<0.01)。

圖2 大鼠體質量變化趨勢圖

Fig.2 The trend of body weight change in rats

3.3肝臟指數(shù)變化 正常對照組與肝癌模型組大鼠肝臟質量與肝臟指數(shù)變化見表1。由表1可知，與正常對照組大鼠比較，肝癌模型組大鼠的肝臟質量與肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 大鼠肝臟質量及肝臟指數(shù)

Tab.1 Liver weight and liver index in rats

組別n肝臟質量均值/g 肝臟指數(shù)/mg·g-1正常對照組1011.76±1.14 25.36±2.75肝癌模型組924.48±5.82# 61.34±2.62#

注：與正常對照組比較#P<0.01。

3.4尿液核磁共振檢測的各項代謝物變化 核磁共振氫譜見圖3。由圖3A可知，采用OPLS-DA分析后，正常對照組與肝癌模型組大鼠實驗參數(shù)分別為R2=0.394，Q2=0.831，說明OPLS-DA分析模型得到了較好的分離，2組間差異明顯。由圖3B可知，外部驗證分析參數(shù)分別為R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)，表明正常對照組和肝癌模型組代謝成分有明顯差異，顯示PLS模式分析有效，具有預測能力。根據(jù)1H-NMR譜顯示，與正常對照組比較，肝癌模型組大鼠尿液代謝物的含量變化較明顯，肝癌模型組中含量明顯減少的尿液代謝物有異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、醋酸鹽、糖蛋白、丙酮酸鹽、琥珀酸鹽、α-酮戊二酸、苯丙酸鹽和甲酸鹽10種，而含量明顯升高的代謝物有檸檬酸、二甲基亞硝酸、肌酸、牛磺酸和肌酸酐5種，見圖4和表2。對含量變化明顯的代謝物參與的代謝通路運用MetaboAnalyst 3.0進行分析，得出共有4種代謝通路發(fā)生了明顯變化，見表3。

圖3 大鼠尿液OPLS-DA分析的得分圖與排列驗證實驗結果

A.尿液核磁共振氫譜的OPLS-DA分析的得分圖；B.排列驗證實驗結果：R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)。

Fig.3 The score plot and arrangement test results analysis of rat urine OPLS-DA

A.score plot of OPLS-DA analysis of urine nuclear magnetic resonance spectroscopy；B.arrangement verification test results，R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221).

圖4 尿液核磁共振氫譜圖

a.肝癌模型組，b正常對照組；1.異亮氨酸；2.乳酸；3.丙氨酸；4.醋酸鹽；5.糖蛋白；6.丙酮酸鹽；7.琥珀酸鹽；8.檸檬酸；9.二甲基亞硝酸；10.α-酮戊二酸；11.肌酸；12.?；撬?；13.肌酸酐；14.苯丙氨酸；15.甲酸鹽。

Fig.4 Urine nuclear magnetic resonance spectroscopy

a.hepatocellular carcinoma model group；b.normal control group；1.isoleucine；2.lactic acid；3.alanine；4.acetate；5.glycoprotein；6.pyruvate；7.succinate；8.citric acid；9.dimethyl-nitrosamine；10.α-ketoglutaric acid；11.creatine；12.taurine；13.creatinine；14.phenylalanine；15.formate.

表2 尿液中差異性代謝物及其VIP值

Tab.2 The difference of metabolites in the urine and their VIP value

代謝物化學位移歸屬VIP值異亮氨酸0.92(t)δ-CH32.277乳酸1.32(d),4.11(q)CH3,CH4.228丙氨酸1.47(d)CH3,CH1.597醋酸鹽1.91(s)CH37.955糖蛋白2.03(s)CH31.448丙酮酸鹽2.22(s)CH31.448琥珀酸鹽2.40(s)CH22.724檸檬酸2.53(d)CH2,CH26.985二甲基亞硝酸2.71(s)CH33.009α-酮戊二酸3.02(t)12.666肌酸3.03(s)CH36.945?；撬?.25(t),3.41(t)CH2SO35.253肌酸酐4.05(s)CH21.598苯丙氨酸 7.37(m)H41.583甲酸鹽8.45(s)CH1.326

注：s為單峰，d為雙重峰，t為三重峰，q為四重峰，m為多重峰。

表3 差異性代謝通路分析

Tab.3 Different metabolic pathways analysis

差異性代謝通路影響因子P丁酸代謝0.041 070.001 014檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))0.147 210.001 014乙醛酸和二羧酸代謝通路0.407 410.011 763苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成0.500 000.042 158

4 結論

代謝組學通過分析體內小分子代謝物的變化，尋找與疾病相關的潛在鑒別標志物，由此在臨床疾病診斷中有突出的優(yōu)勢，可提供早期診斷依據(jù)[12]。本研究使用DEN造模，采集大鼠尿液，并對其進行檢測與分析。研究結果證明，肝癌導致大鼠尿液代謝物成分變化明顯，會引起代謝通路的改變。

研究結果表明，與丁酸代謝通路相關的代謝物有丙酮酸鹽和琥珀酸鹽，二者在肝癌大鼠動物模型中的含量明顯降低。琥珀酸半醛和丙氨酸是γ-氨基丁酸(GABA)在γ-氨基丁酸轉氨酶(GABA-T)的催化下與丙酮酸反應生成，而GABA主要是由Glu在α-位上的脫羧反應合成。琥珀酸半醛脫氫酶(Succinate semlalehyde dehydro-genase，SSADH) 氧化 SSA 形成琥珀酸進入三羧酸循環(huán)[13]。還原型輔酶Ⅰ(NADH)對以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為輔助因子的SSADH活性有抑制作用，SSADH 酶活性高低與NADH的濃度相關。琥珀酸半醛能被SSADH可逆性地催化形成琥珀酸，然而在GABA代謝旁路中關鍵的酶是SSADH。肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中體內能量的變化可能是由SSADH的活性變化所致[14]。

檸檬酸循環(huán)(TCA)是許多重要物質生物合成的前提，也是多種能量代謝聯(lián)系的樞紐，更是三大營養(yǎng)素的最終代謝通路。檸檬酸脫氫酶(ICDHm)活性影響TCA循環(huán)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成，同時NADPH所提供的質子數(shù)量也能影響活性氧自由基(ROS)在體內的代謝，因此ROS的清除能力受ICDHm在TCA循環(huán)中的活性的影響。NADH與還原型黃素二核苷酸(FADH2)共同作用促使二磷酸腺苷(ADP)和Pi反應合成腺苷三磷酸(ATP)，產(chǎn)生ROS。TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物(如草酰乙酸和α-酮戊二酸)是氨基酸和脂肪的原料。在TCA循環(huán)中，通過產(chǎn)物的反饋抑制實現(xiàn)檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié)。肝臟細胞中的線粒體在合成ATP的同時會生成ROS，其含量共同調節(jié)著機體的細胞凋亡和基因表達等生理生化活動，二者在機體內處于動態(tài)平衡[15-16]。2個單位的乙酰輔酶A經(jīng)過乙酰循環(huán)生成1分子的琥珀酸是乙醛酸循環(huán)總體反應的最主要途徑，新合成的琥珀酸從乙酰酸體轉移到線粒體，并在線粒體中轉變?yōu)樘O果酸，草酰乙酸在檸檬酸合酶的作用下生成檸檬酸[17]。二羧酸是脂肪酸進入三羧酸循環(huán)的關鍵步驟，是乙酰輔酶A生物合成的關鍵通道，限速酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。

研究結果表明，二羧酸通路中的甲酸鹽在肝癌模型組大鼠尿液中的含量明顯降低，進一步證明其與肝癌模型組大鼠體內能量的消耗有關。但肝癌模型組大鼠尿液中檸檬酸的含量增多，TCA循環(huán)中NAD+將α-酮戊二酸氧化并釋放ATP變成琥珀酸，在檸檬酸和α-酮戊二酸的進一步氧化過程中起到關鍵作用的是NAD+/NADH的活性。NAD+/NADH的濃度直接影響細胞的衰老、癌變和死亡等生命過程[18-20]。

在肝臟中有大部分氨基酸分解代謝。甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸等生物合成或降解的主要通道是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路[21]。苯丙氨酸在醫(yī)學、營養(yǎng)學等領域均有應用，是人體必需的氨基酸[22]。為了達到抑制腫瘤細胞生長的目的，需要苯丙氨酸解氨酸(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)生成反式苯丙烯酸，從而降解腫瘤細胞所需的特異性代謝前體[23]。實驗結果表明，肝癌模型組大鼠模型中苯丙氨酸含量明顯降低，考慮可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。

有學者利用核磁共振對肝硬化與肝癌患者的血清進行了代謝組學研究。結果顯示，與健康人相比，肝硬化與肝癌患者血清中醋酸鹽、丙酮酸鹽、谷氨酰胺、甘油、酪氨酸、異亮氨酸、乙酰乙酸和肌酸等含量有顯著變化，實驗結果顯示，在肝癌模型組大鼠尿液中醋酸鹽、丙酮酸鹽和異亮氨酸代謝物的含量明顯降低，肌酸的含量增加。

腫瘤細胞代謝極其旺盛，癌癥的發(fā)展時刻伴隨著體內代謝物的變化，因此本實驗運用代謝組學方法，使用化學致癌劑DEN誘導建立肝癌大鼠模型，通過肝癌模型組大鼠尿液代謝物含量的變化得出大鼠體內有4種代謝通路發(fā)生了明顯變化。本實驗結果可為肝癌的基礎研究和早期診斷提供參考依據(jù)。