三磷酸腺苷二鈉片對慢性高原病模型大鼠多器官損傷的改善作用

楊 濤，史 超，艾尼娃爾·艾克木，是文輝，張向陽，迪麗努爾·買買提依明*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合心臟內(nèi)科，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；4.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，烏魯木齊 830000)

慢性高原病(CMS)或蒙赫氏病是世界上多數(shù)高海拔地區(qū)高度流行的進行性喪失能力綜合征[1-2]。世界上有超過1億4 000萬人生活在海拔2 500 m以上地區(qū)，其中5%～10%的人有患CMS的風(fēng)險。三磷酸腺苷二鈉片(ADT)是核苷酸衍生物，參與機體內(nèi)的多種代謝。研究表明[3-5]，三磷酸腺苷二鈉片對缺血缺氧再灌注腎臟和腦損傷具有不同程度的保護作用。

本實驗擬在模擬高海拔環(huán)境，構(gòu)建慢性高原病模型，灌胃不同劑量的三磷酸腺苷二鈉片，測定各組大鼠的肺動脈壓力(PAP)，檢測血清中細(xì)胞因子內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和一氧化氮(NO)的含量，觀察腎、腦和肺的病理學(xué)改變，并測定各組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)水平，旨在研究三磷酸腺苷二鈉片對長期暴露于高原環(huán)境中所致多種器官損傷的改善作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 Model 680型酶標(biāo)儀，1575型immunowash微孔板洗板機(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；TGL-16G型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LEICA EM UC6型切片機(德國徠卡公司)；西北特殊環(huán)境人工實驗艙，位于新疆軍區(qū)總醫(yī)院。

1.2試藥 三磷酸腺苷二鈉片(成都天臺山制藥有限公司，批號120601)；硝苯地平片(山西云鵬制藥有限公司，批號C120304)。大鼠NO Elisa試劑盒(批號NH163CS)、大鼠VEGF Elisa 試劑盒(批號3203040)、大鼠ET-1 Elisa試劑盒(批號8264255)，均購于上海西唐生物科技有限公司。SOD(批號20130410)、MDA(批號20130409)和GSH-Px(批號20130401)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動物 SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為180±20 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，許可證號：SCXK(新)2011-0004。

2 方法

2.1CMS模型大鼠的建立和分組 將60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、硝苯地平組及三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組。

CMS模型：將除對照組外的5組大鼠放入人工實驗艙飼養(yǎng)，每組10只。模擬海拔5 000 m；溫度：20±2 ℃；濕度：40%±10%；壓力：54.1 kPa；氧分壓：13.01 kPa。飼養(yǎng)30 d后給予以下處理：模型組：給予蒸餾水4 mL·kg-1·d-1，灌胃15 d；硝苯地平組：給予硝苯地平2.7 mg·kg-1·d-1，灌胃15 d；三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組分別給予三磷酸腺苷二鈉 片3.239 8，1.619 9和0.809 9 mg·kg-1·d-1，灌胃 15 d。

對照組：將10只SD大鼠放入SPF環(huán)境中，模擬海拔730 m；溫度：22±4 ℃；濕度：40%～60%；壓力：93.2 kPa；氧分壓為：19.54 kPa。飼喂30 d后，給予蒸餾水4 mL·kg-1·d-1，灌胃15 d。

2.2CMS模型大鼠PAP的測定 最后一次干預(yù)治療24 h后，大鼠采用常規(guī)麻醉，固定于手術(shù)臺，完全將心肺露出，采用自制壓力測定器測定大鼠PAP，記錄實驗結(jié)果。

2.3CMS模型大鼠血清指標(biāo)的測定 打開大鼠腹腔，完全暴露腹主動脈后采血，在常溫環(huán)境下靜置30 min，以3 000 r·min-1離心20 min，吸取血清，依照說明書方法檢測血清中ET-1、VEGF和NO的含量。

2.4大鼠各組織的病理學(xué)檢查 摘取大鼠的肺和大腦，使用蘇木精-伊紅染色法，觀察其病理學(xué)改變。

2.5大鼠各組織中MDA、SOD與GSH-Px活性及水平的測定 將2.4項下摘取的器官制備成10%的細(xì)胞混懸液，在低溫條件下以3 000 r·min-1離心20 min，棄掉沉淀物，分別用Elisa試劑盒檢測MDA、SOD與GSH-Px的活性及水平。

3 結(jié)果

3.1CMS模型大鼠PAP的檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組、硝苯地平組和三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠PAP均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相較于模型組，硝苯地平組大鼠PAP明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組PAP明顯上升，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組PAP顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 CMS大鼠肺動脈壓力的檢測結(jié)果

組別肺動脈壓力/mmHg對照組20.36±2.31模型組43.17±3.46a硝苯地平組29.45±3.14ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組34.21±4.21abc三磷酸腺苷二鈉片中劑量組35.75±4.02abc三磷酸腺苷二鈉片低劑量組36.34±4.12abc

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

3.2CMS模型大鼠血清中VEGF、NO和ET-1的含量測定結(jié)果 與對照組比較，模型組、硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片中、低劑量組大鼠血清VEGF和ET-1含量明顯升高(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠血清VEGF含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，硝苯地平組和三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清中VEGF和ET-1含量顯著下降(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中劑量組大鼠血清VEGF和ET-1含量顯著下降(P<0.05)；三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠血清中VEGF含量顯著下降(P<0.05)。

與對照組比較，模型組、硝苯地平組以及三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清NO含量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片高、中、低劑量組大鼠血清NO含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

3.3病理學(xué)檢查結(jié)果

3.3.1腦組織 對照組大鼠腦組織在低倍鏡下可見腦膜較薄，未見充血、出血和脫落情形；在高倍鏡下可見腦實質(zhì)錐體細(xì)胞層部分血管輕度出血，未見明顯異常改變。多數(shù)錐體細(xì)胞大小正常，未見明顯變形。模型組大鼠腦組織在低倍鏡下可見腦膜血管下擴張充血嚴(yán)重，腦實質(zhì)血管周圍腔擴張，內(nèi)有滲出液；在高倍鏡下可見大腦錐體細(xì)胞增大部分血管管腔擴張并小范圍水腫。硝苯地平組大鼠腦組織在低倍鏡下腦膜內(nèi)未見異常滲出物附著，腦膜血管未見出血和水腫等情形；在高倍鏡下可見大部分腦實質(zhì)血管管腔擴張并充血。三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下可見腦實質(zhì)外錐體細(xì)胞層部分血管明顯擴張充血；在高倍鏡下可見近出血部位腦實質(zhì)疏松腫脹。三磷酸腺苷二鈉片中劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下腦膜內(nèi)未見明顯異常滲出物附著現(xiàn)象，海馬區(qū)部分神經(jīng)元排列紊亂；在高倍鏡下腦實質(zhì)未見明顯異常。三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠腦組織在低倍鏡下可見腦膜內(nèi)輕度出血；在高倍鏡下腦實質(zhì)外錐體細(xì)胞層未見明顯異常，腦實質(zhì)存在輕度水腫，病變程度比三磷酸腺苷二鈉片低劑量組略輕。見圖1。

表2 各組大鼠血清中VEGF、NO和ET-1含量的測定結(jié)果

組別VEGF/pg·mL-1ET-1/pg·mL-1NO/μmol·mL-1對照組45.36±3.2152.36±4.2828.36±2.78模型組182.32±8.62a93.25±3.65a14.25±2.45a硝苯地平組 133.74±5.37ab72.89±1.55ab 21.71±1.64ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組103.62±4.18abc56.37±3.54bc24.14±2.01ab三磷酸腺苷二鈉片中劑量組86.85±4.36abc67.25±5.65abc 23.07±1.98ab三磷酸腺苷二鈉片低劑量組78.17±3.56abc73.24±3.66ab21.37±1.22ab

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

3.3.2肺組織 對照組大鼠肺組織在低倍鏡下結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁較薄，肺泡腔清晰；在高倍鏡下部分肺泡間隔輕微增厚，無明顯病理改變，未見肺泡間隔增生、充血等異常改變。模型組大鼠肺組織在低倍鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增生；在高倍鏡下肺組織部分血管擴張充血，個別肺泡腔內(nèi)有滲出液且充血，肺間質(zhì)水腫并有大量炎細(xì)胞浸潤。硝苯地平組在低倍鏡下可見部分肺泡間隔明顯增厚；在高倍鏡下可見肺泡壁增厚，部分肺泡壁毛細(xì)血管擴張充血。三磷酸腺苷二鈉片低劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見肺泡壁較薄，肺泡腔清晰；在高倍鏡下部分肺泡間隔毛細(xì)血管擴張出血，部分肺泡塌陷，部分肺泡代償性擴張。三磷酸腺苷二鈉片中劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡塌陷；在高倍鏡下存在肺泡間隔毛細(xì)血管擴張出血。三磷酸腺苷二鈉片高劑量組大鼠肺組織在低倍鏡下可見肺泡壁增厚，肺泡腔不清，部分肺泡腔內(nèi)有滲出液；在高倍鏡下可見明顯炎細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖1 腦組織病理學(xué)結(jié)果

A.對照組(×100)；B.對照組(×400)；C.模型組(×100)；D.模型組(×400)；E.硝苯地平組(×100)；F.硝苯地平組(×400)；G.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×100)；H.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×400)；I.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×100)；J.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×400)；K.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×100)；L.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×400)。

Fig.1 Pathological results of brain tissue

A.control group(×100)；B.control group(×400)；C.model group(×100)；D.model group(×400)；E.nifedipine group(×100)；F.nifedipine group(×400)；G.HADT group(×100)；H.HADT group(×400)；I.MADT group(×100)；J.MADT group(×400)；K.LADT group(×100)；L.LADT group(×400).

圖2 肺組織病理學(xué)結(jié)果

A.對照組(×100)；B.對照組(×400)；C.模型組(×100)；D.模型組(×400)；E.硝苯地平組(×100)；F.硝苯地平組(×400)；G.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×100)；H.三磷酸腺苷二鈉片高劑量組(×400)；I.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×100)；J.三磷酸腺苷二鈉片中劑量組(×400)；K.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×100)；L.三磷酸腺苷二鈉片低劑量組(×400)。

Fig.2 Pathological results of lung tissue

A.control group(×100)；B.control group(×400)；C.model group(×100)；D.model group(×400)；E.nifedipine group(×100)；F.nifedipine group(×400)；G.HADT group(×100)；H.HADT group(×400)；I.MADT group(×100)；J.MADT group(×400)；K.LADT group(×100)；L.LADT group(×400).

3.4大鼠各組織中MDA、SOD與GSH-Px的活性與水平 與對照組比較，模型組、硝苯地平組、三磷酸腺苷二鈉片高、中和低劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)；MDA水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，硝苯地平組以及三磷酸腺苷二鈉片高、中和低劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。與硝苯地平組比較，三磷酸腺苷二鈉片高、中劑量組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 肺組織中MDA、GSH-Px和SOD測定結(jié)果

組別MDA/nmol·mg-1SOD/U·mg-1GSH-Px/U·mg-1對照組9.24±1.02130.54±17.41240.37±20.36模型組14.14±1.45a60.44±12.34a83.21±14.27a硝苯地平組12.36±1.24ab80.45±17.21ab154.17±15.88ab三磷酸腺苷二鈉片高劑量組9.36±1.54bc128.21±11.14bc230.14±21.54bc三磷酸腺苷二鈉片中劑量組10.33±1.71abc100.41±16.42abc180.45±17.14abc三磷酸腺苷二鈉片低劑量組12.74±1.24abc70.45±13.25abc172.45±14.21abc

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與硝苯地平組比較cP<0.05。

4 討論

抗氧化酶活性的改變和非酶抗氧劑的減少都會導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。正常的生物過程不斷產(chǎn)生活性氧，活性氧可被機體的抗氧化酶，包括SOD、GSH-Px和一些保護性化合物清除?？偝趸锲缁?T-SOD)和GSH-Px是通過氧自由基向過氧化氫轉(zhuǎn)化為自由基的天然清除劑[8-10]。為了消除來自細(xì)胞環(huán)境的破壞性活性氧物種。通過測定T-SOD和GSH-Px等主要抗氧化酶可以明確機體的抗氧化狀態(tài)。丙二醛(MDA)已被廣泛用作生物標(biāo)志物來評價生物過程中的脂質(zhì)過氧化，盡管人們認(rèn)為它隨著各種疾病的增加而與自由基損傷有關(guān)[11-13]。實驗結(jié)果顯示，CMS模型組大鼠肺組織中GSH-Px和SOD活性降低，MDA水平升高，表明大鼠長期暴露于低壓低氧環(huán)境中，會對機體肺和腦等重要器官造成氧化損傷。采用三磷酸腺苷二鈉片干預(yù)治療后，三磷酸腺苷二鈉低、中、高劑量組大鼠肺、腎組織中GSH-Px和SOD活性均不同程度增強，MDA水平不同程度下降，表明三磷酸腺苷二鈉片可提高機體中抗氧化酶的活性，從而減輕氧化應(yīng)激對CMS大鼠多種重要器官造成的損傷。

VEGF是具有促進血管生長作用的因子[14-15]，其在低氧環(huán)境下不僅可以促進內(nèi)皮細(xì)胞增生，還可增加血管通透性。實驗結(jié)果顯示，CMS模型大鼠VEGF含量升高，給予三磷酸腺苷二鈉片后，三磷酸腺苷二鈉片低、中和高劑量組VEGF含量均不同程度降低。NO是由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化2-氨基-5-胍基戊酸脫去胍基所產(chǎn)生的血管舒張因子[16]；內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是維持心血管功能的重要物質(zhì)，ET-1是內(nèi)皮素家族血管收縮作用最強大的物質(zhì)[17-20]。通常ET與NO在機體內(nèi)保持著動態(tài)平衡，ET可通過增加鈣離子內(nèi)流，促使NO產(chǎn)生，從而擴張血管；NO則可通過內(nèi)皮細(xì)胞生成鳥苷-3′，5′-環(huán)化-磷酸(cGMP)，從而抑制ET的合成和釋放[21-22]。實驗結(jié)果顯示，CMS模型大鼠血清的ET-1含量升高，NO含量降低，給予三磷酸腺苷二鈉片干預(yù)后，三磷酸腺苷二鈉片低、中、高劑量組ET-1含量均不同程度降低，NO含量不同程度升高。提示CMS模型大鼠體內(nèi)ET和NO含量處于失衡狀態(tài)，從而使PAP升高，引起多種臟器的損傷，給予三磷酸腺苷二鈉片后，失衡狀態(tài)有所改善。

綜上所述，機體長期暴露于高原環(huán)境中，低壓低氧會引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機體重要器官損傷，三磷酸腺苷二鈉片對這種氧化應(yīng)激反應(yīng)具有不同程度的改善作用。