200例稽留流產(chǎn)絨毛染色體的間期FISH分析

劉丹，丁翔，唐國(guó)棟，王燕春

(北京市海淀區(qū)婦幼保健院，北京 100080)

稽留流產(chǎn)是一種特殊但常見(jiàn)的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率逐年增加。除了遺傳和子宮畸形等解剖學(xué)因素外，染色體異常是早期最常見(jiàn)和最重要的原因[1]。目前，臨床實(shí)踐中最常用的基因診斷技術(shù)是分析染色體G帶的核型分析技術(shù)、細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-磁珠分離法(BoBs)分子診斷技術(shù)和熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)(FISH)。近年，隨著染色體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，間期FISH克服了對(duì)樣本要求較高、細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)、失敗率高等缺點(diǎn)成為具有快速、準(zhǔn)確、靈活特征的新型檢測(cè)方法。本研究中回顧性分析2016年1月至2018年9月在我院接受治療的稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織進(jìn)行了間期FISH檢測(cè)，并將結(jié)果報(bào)告如下。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象：收集2016年1月至2018年9月在我院門診就診和病房住院的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：行B超檢查、血HCG和孕酮聯(lián)合檢測(cè)診斷為“稽留流產(chǎn)”、胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自行排出需接受手術(shù)治療并要求檢測(cè)絨毛染色體的患者；身心健康，月經(jīng)規(guī)律；血清檢查TORCH感染陰性；妊娠以來(lái)未使用過(guò)激素類藥物；無(wú)煙酒愛(ài)好、無(wú)接觸X射線和有毒物質(zhì)的過(guò)去史；無(wú)子宮畸形。排除一些基礎(chǔ)性疾病史，如糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病、精神疾病、遺傳性疾病等。共納入200例稽留流產(chǎn)患者。所有患者在進(jìn)行相關(guān)檢查前均充分知情同意，并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

2．試劑和儀器：主要實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)自北京博奧生物有限公司和北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。相關(guān)試劑：緩沖貯存液：20×SSC，PH 5.3，用去離子水稀釋至500 ml，2～8°保存；緩沖液：2×SSC，PH(7.0±0.2)；變性液：70%(v/v)甲酰胺/2×SSC；乙醇溶液(70%乙醇、85%乙醇)；甲酰胺洗滌液：50%(v/v)甲酰胺/2×SSC；洗滌液：0.1%NP-40/2×SSC溶液，PH(7.0±0.2)；快洗洗滌液：0.3%NP-40/0.4×SSC溶液，PH 7.0～7.5；KCl低滲溶液(0.075 mol/L KCl)；固定液(甲醇∶冰乙酸體積比3∶1)；5 mg/ml DAPI復(fù)染劑母液(購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，0.2 μg/ml DAPI復(fù)染劑母液。

FISH探針：購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。探針包括基因位點(diǎn)特異性探針和著絲粒特異性探針，分為3組：(1)GLP 13/GLP 21(DLEU2位點(diǎn)，標(biāo)綠色；DSCR2位點(diǎn)，標(biāo)紅色)；(2)GLP 16/GLP 22(CBFB位點(diǎn)，標(biāo)紅色；BCR位點(diǎn)，標(biāo)綠色)；(3)CSP 18/CSP X/CSP Y(18號(hào)染色體著絲粒，標(biāo)天藍(lán)色；X染色體著絲粒，標(biāo)綠色；Y染色體著絲粒，標(biāo)紅色)。在42℃環(huán)境中，這些單鏈樣本和探針核酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理特異性結(jié)合。正常細(xì)胞分別顯示2個(gè)DLEU2、DSCK2、CBFB、BCR基因座信號(hào)和2個(gè)18號(hào)、2個(gè)X或1個(gè)X、1個(gè)Y著絲粒信號(hào)。如果信號(hào)變化數(shù)目異常，則表明該標(biāo)本染色體數(shù)目為非正常。

3.實(shí)驗(yàn)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)治療后取0.5 mg絨毛組織置于15 ml尖底離心管內(nèi)，用剪刀剪碎，鹽水沖洗，離心去上清，60%的冰醋酸3～4 ml混勻，消化5 min，固定液固定，滴片，老化玻片，將該玻片于胃蛋白酶消化后漂洗5 min，依次置于預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中進(jìn)行梯度脫水3 min。將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和1 μl探針依次加至離心管中。離心1～3 s，混合渦旋后再次短暫離心。在(73±1)℃水浴鍋中持續(xù)變性5 min，置于45～50℃水浴，雜交前取出。為了避免氣泡，將該玻片置于預(yù)熱的濕盒內(nèi)并在42℃培養(yǎng)箱內(nèi)雜交過(guò)夜。甲酰胺洗滌玻片。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：探針1：GLP 13/GLP 21正常信號(hào)類型：?jiǎn)卧@示2個(gè)綠色信號(hào)(DLEU2站點(diǎn))和2個(gè)紅色信號(hào)(DSCR2站點(diǎn))；異常信號(hào)類型：細(xì)胞顯示單個(gè)或者3個(gè)及3個(gè)以上綠色信號(hào)和/或紅色信號(hào)。探針2：GLP 16/GLP 22正常信號(hào)類型：細(xì)胞顯示兩個(gè)紅色信號(hào)(CBFB位點(diǎn))和兩個(gè)綠色信號(hào)(BCR位點(diǎn))；異常信號(hào)類型：細(xì)胞顯示單個(gè)或者3個(gè)及3個(gè)以上綠色信號(hào)和/或紅色信號(hào)。探針3：CSP 18/CSP X/CSP Y正常信號(hào)類型：細(xì)胞顯示兩個(gè)天藍(lán)色信號(hào)(染色體18上的中心體)，2個(gè)綠色信號(hào)(X染色體著絲粒位點(diǎn))(雌性)或2個(gè)天藍(lán)色信號(hào)(中心體18個(gè)著絲粒)，1個(gè)綠色信號(hào)(X染色體著絲粒位點(diǎn))，1個(gè)紅色信號(hào)(Y染色體著絲粒位點(diǎn))(雄性)；異常信號(hào)類型：細(xì)胞顯示單個(gè)或者3個(gè)及3個(gè)以上天藍(lán)色信號(hào)，和/或出現(xiàn)非正常數(shù)目情況下的綠色和/或紅色信號(hào)。

隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，超過(guò)90%顯示正常類型提示為正常樣本；超過(guò)60%的細(xì)胞顯示異常信號(hào)類型，視為樣本異常。

二、結(jié)果

研究共納入200例患者，年齡22～47歲，孕周6～13周。200例絨毛組織樣本的間期FISH均獲得雜交信號(hào)，其中112例(56.00%)雜交結(jié)果異常標(biāo)本中：常染色體單體2例，占1.79%(2/112)；常染色體三體型72例，占64.29%(72/112)；性染色體單體型19例，占16.96%(19/112)；性染色體三體型2例，占1.79%(2/112)；三倍體10例，占8.93%(10/112)；四倍體、嵌合體各1例，分別占0.89%(1/112)；其他5例，占4.46%(5/112)。具體間期FISH圖象和核型資料詳見(jiàn)圖1、表1。

三、討論

稽留流產(chǎn)目前是全球臨床妊娠最多見(jiàn)的并發(fā)癥之一，隨著人們生活節(jié)奏越來(lái)越快，工作壓力、精神壓力不斷增高以及環(huán)境的不斷惡化，該患病率逐年呈上升趨勢(shì)，不可避免地影響夫妻心身健康和家庭幸福感。尋找流產(chǎn)原因及指導(dǎo)下次妊娠成為當(dāng)下亟待解決的問(wèn)題及科研熱點(diǎn)。非整倍體是影響胚胎健康發(fā)育的主要因素[2]。染色體數(shù)目改變可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)死產(chǎn)增加，即使正常分娩，個(gè)體發(fā)育容易出現(xiàn)性別發(fā)育障礙等問(wèn)題。本研究中，200例稽留流產(chǎn)樣本中檢測(cè)到112例異常，檢出率為56.00%，與之前文獻(xiàn)[3]報(bào)道的50%以上相似，表明絨毛染色體的核型異?？赡苁菍?dǎo)致胎停育的主要原因。但由于方法學(xué)限制，間期FISH只可檢測(cè)出染色體13、16、18、21、22、X和Y的數(shù)目異常，無(wú)法檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)再次重排和變異的異常。本研究檢測(cè)到的異常類型中最常見(jiàn)的為常染色體三體。其中，16位和22位的三體最多，表明16和22三倍體可能是導(dǎo)致胚胎停育的高發(fā)類型，其次是21號(hào)三體。常染色體單倍型僅2例，因?yàn)閱伪缎途哂械痛婊盥?，其少?jiàn)于妊娠早期的生化妊娠。三倍體異常可以來(lái)自新的突變，或者配子在減數(shù)分裂過(guò)程中不分離，或者受精過(guò)程中分離異常[4]。這種異常類型通常在妊娠8周之前終止，并且關(guān)于純?nèi)扼w活嬰報(bào)道很少。其次是21例性染色體畸變，除2例性染色體三體外，其余19例均為特納(Turner)綜合征。45，X單體是人類唯一能生存的單體綜合征，患者第二性征發(fā)育不全且伴有原發(fā)性閉經(jīng)[5]。其異常核型包括：(1)45，XO，是最多見(jiàn)的一型，95%的胚胎發(fā)生自然流產(chǎn)，只有少數(shù)幸存，且具有較為典型的特殊臨床表現(xiàn)；(2)45，XO/46，XX即嵌合型，約占Turner綜合征的25%；(3)46，Xdel(Xp)或46，Xdel(Xq)，即一條X染色體的短壁或長(zhǎng)臂缺失；(4)46，Xi(Xq)：即一條X染色體的短臂已缺失，形成等臂染色體[6]。

圖1 112例異常染色體核型間期FISH檢測(cè)結(jié)果示例

染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常是稽留流產(chǎn)的主要原因之一[7]。由于FISH檢查本身的局限性，本研究未能對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測(cè)。自然流產(chǎn)是生物進(jìn)化中異常生命體自然淘汰的過(guò)程，是人類生殖過(guò)程重要的優(yōu)生選擇機(jī)制。此外，精神壓力，包括過(guò)度緊張、焦慮、恐懼、悲傷，甚至噪音影響[8]；流產(chǎn)次數(shù)[9]；遺傳基因缺陷：例如，夫婦的年齡、一方的染色體變異、夫妻的血型等[10]；不良生活習(xí)慣：如過(guò)度吸煙、酗酒、過(guò)量咖啡、海洛因等；環(huán)境因素，如空氣污染等[11]；母體本身疾病，如：生殖器官異常、HPV感染、CMV感染等；內(nèi)分泌異常：嚴(yán)重的糖尿病未得到控制、黃體功能不足、甲狀腺功能降低、多囊卵巢綜合征；免疫功能異常等[12]均可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)。Li等[13]通過(guò)使用qRT-PCR、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)通過(guò)參與介導(dǎo)血清雌二醇和孕酮的表達(dá)水平以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，為治療稽留流產(chǎn)提供了新的診斷和治療策略。近年來(lái)對(duì)傷寒沙門氏菌等的探討對(duì)未來(lái)稽留流產(chǎn)的診療策略提供了廣泛的前景[14]。由于該種流產(chǎn)通常有相對(duì)較多的壞死組織、血凝塊和其他雜質(zhì)，大多數(shù)絨毛細(xì)胞已經(jīng)機(jī)化和變性，可以培養(yǎng)出細(xì)胞分裂象的幾率相對(duì)較小，染色體形態(tài)畸變不符合檢測(cè)要求，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。而間期FISH檢測(cè)不需要細(xì)胞培養(yǎng)，因此不受組織污染的影響，具有樣本量小、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、成功率高的優(yōu)點(diǎn)。可以為發(fā)病原因探討提供一定的理論依據(jù)，對(duì)于遺傳咨詢和指導(dǎo)下一次妊娠也具有積極意義[15]；但是，由于FISH只能檢測(cè)出7對(duì)染色體(13、16、18、21、22、X和Y)的數(shù)量，尚不能檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)重排和變異，且該檢測(cè)方法對(duì)溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值要求較高、費(fèi)用相對(duì)昂貴，使其不能被大眾普遍認(rèn)可，也成為該方法臨床應(yīng)用的自身局限性。

表1 112例異常染色體類型和例數(shù)

綜上所述，染色體異?？赡苁腔袅鳟a(chǎn)發(fā)生的主要因素之一；間期FISH的檢測(cè)方法對(duì)于稽留流產(chǎn)的病因診斷有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但是是否值得臨床普及推廣還需要進(jìn)一步探討驗(yàn)證。