超聲萃取-重氮偶合光度法快速檢測(cè)發(fā)酵茶中亞硝酸鹽

李佳明，裴紅運(yùn)，趙文婧，高玉花，張向陽(yáng)*

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，272067

茶葉是我國(guó)的國(guó)飲，含有咖啡堿、多酚類化合物、維生素類、氨基酸類等，因具有降血脂、減肥、預(yù)防心血管疾病、抗輻射、抗氧化、延緩衰老、助消化等作用，而被譽(yù)為健康的自然護(hù)衛(wèi)者[1]。古小玲[2]、邱賀媛等[3]曾開展過(guò)茶葉中亞硝酸鹽檢測(cè)研究，但目前我國(guó)尚未制訂茶葉中亞硝酸鹽含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于茶葉中亞硝酸鹽含量的測(cè)定研究鮮有報(bào)道，因此筆者對(duì)不同種類發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量進(jìn)行了測(cè)定，并建立了一套快速的測(cè)定方法，以供行業(yè)相關(guān)人員參考。

一、材料與方法

1.試劑與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)材料

市場(chǎng)購(gòu)買的半發(fā)酵茶（鐵觀音、大紅袍），全發(fā)酵茶（正山小種、金駿眉），后發(fā)酵茶（湖南安化黑茶、云南普洱茶）。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器

754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、電子天平FA2104N（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高速粉碎機(jī)、硅膠干燥器、KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、雙列八孔電熱恒溫水浴鍋、UPD-IV-10T（純水型）優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、常用實(shí)驗(yàn)玻璃儀器。

（3）實(shí)驗(yàn)試劑

所用試劑均為分析純（亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、二鹽酸-1-萘乙二胺、亞硝酸鈉、濃鹽酸、冰醋酸、濃硫酸、堿式乙酸鉛），所用水為超純水（自制）。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法

（1）樣品預(yù)處理

取上述市購(gòu)的6 種茶葉烘干至恒重，分別用高速粉碎機(jī)粉碎混勻后裝于密封袋中備用，依次編號(hào)為樣品1～6。

（2）樣品中亞硝酸鹽的提取

分別準(zhǔn)確稱取3.0 g（精度為0.0001 g）經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎混勻的茶葉樣品，分置于6 個(gè)250 mL 錐形瓶中，再分別加入70℃熱水[2]約150 mL，量取5 mL飽和硼酸鈉溶液（后發(fā)酵茶量取7.5 mL）加入錐形瓶中，攪拌混勻。將上述6個(gè)錐形瓶放入數(shù)控超聲波清洗器中超聲萃取10 min[4]（40 kHz，40 W）。

（3）超聲萃取液的凈化

在6 種萃取液中分別加入2.5 mL 亞鐵氰化鉀溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻；再分別加入2.5 mL 乙酸鋅溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻。冷卻至室溫的6 種萃取液分別轉(zhuǎn)移到6 個(gè)250 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，放置30 min。分別用濾紙干過(guò)濾，棄去初濾液15 mL，濾液備用。

（4）濾液的脫色

取50 mL 經(jīng)凈化處理后的濾液于100 mL 容量瓶中，加1 mL 飽和堿式乙酸鉛溶液，加水定容，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液數(shù)滴，在上述濾液中取50 mL 于100 mL 容量瓶中，加0.05 mL 硫酸溶液（4.5 mol/L），加水定容，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液數(shù)滴，濾液為提取液備用。

（5）亞硝酸鹽含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（1 μg/mL），分別置于6 支具塞比色管中，并編號(hào)為標(biāo)1～標(biāo)6。在每支比色管中分別加入0.4 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min，然后加入0.2 mL二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，用分光光度計(jì)于540 nm 處測(cè)定各溶液的吸光度[5]。以亞硝酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

不同發(fā)酵茶提取液中亞硝酸鹽含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取上述6 種脫色液8.0 mL 于6 支具塞比色管中，分別標(biāo)記為樣1～樣6。于6 支具塞比色管中分別加入0.4 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min；然后分別加入0.2 mL 二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），6支具塞比色管均加水定容至10 mL，混勻，靜置15 min。用1 cm 比色皿，以“標(biāo)1”為調(diào)零管，將樣品管1～6 于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，讀取數(shù)據(jù)記錄。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品管中亞硝酸鹽的濃度，并按下式計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的含量。

式中： X 為樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；A1為樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量（μg）；m為樣品的質(zhì)量（g）；V1為測(cè)定用樣液體積（mL）；V0為樣品處理液總體積（mL）。

3.水浴提取-重氮偶合光度法

在上述實(shí)驗(yàn)開始的同時(shí)，按照國(guó)標(biāo)方法——水浴提取-重氮偶合光度法，測(cè)定不同發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量[6]。

二、結(jié)果與分析

1.亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液各管的吸光度依次為0、0.022、0.042、0.062、0.082、0.099，以亞硝酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～0.1 μg/mL 范圍內(nèi)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.99286X+0.00152（Y 為吸光度，X為亞硝酸鹽濃度），相關(guān)系數(shù)為0.99877。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對(duì)已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行20 次測(cè)定，其平均值為0.0971 μg/mL，偏倚為-0.0029 μg/mL，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

同時(shí)，隨機(jī)選取同一樣品6，分別采用超聲萃取-重氮偶合光度法進(jìn)行20 次亞硝酸鹽的提取檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1320%，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.樣品亞硝酸鹽含量的測(cè)定

采用超聲萃取-重氮偶合光度法和水浴提取-重氮偶合光度法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中亞硝酸鹽的濃度，并根據(jù)前文公式計(jì)算出不同茶葉樣品中亞硝酸鹽的含量。提取檢測(cè)過(guò)程重復(fù)20 次，取平均值。兩種方法的測(cè)定結(jié)果（表3），無(wú)差異性。

三、討論

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對(duì)已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行20 次測(cè)定的偏倚為-0.0029 μg/mL，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。同時(shí)采用該方法對(duì)云南普洱茶樣本進(jìn)行20 次亞硝酸鹽提取檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1320%，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性。通過(guò)超聲萃取-重氮偶合光度法20 次提取測(cè)定的鐵觀音、大紅袍、金駿眉、正山小種、安化黑茶、云南普洱茶樣品中的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.50、1.17、1.50、3.87、4.53 mg/kg，水浴提取-重氮偶合光度法20次提取測(cè)定的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.47、1.17、1.53、3.90、4.53 mg/kg。對(duì)比兩種方法所得數(shù)據(jù)，并無(wú)差異性。說(shuō)明超聲萃取-重氮偶合光度法與常規(guī)國(guó)標(biāo)方法——水浴提取-重氮偶合光度法的測(cè)定結(jié)果無(wú)差別，但超聲萃取-重氮偶合光度法測(cè)定發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量簡(jiǎn)便省時(shí)，速度快，且不需要加熱，適應(yīng)于批量測(cè)定[7]。該方法在蔬菜[4-5]、醬腌菜[8]等食品的亞硝酸鹽檢測(cè)中有過(guò)使用報(bào)道，且都達(dá)到了良好的檢測(cè)效果，但用于發(fā)酵茶中亞硝酸鹽的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道，因此，超聲萃取-重氮偶合光度法測(cè)定茶葉樣品中的亞硝酸鹽含量可行。

表1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

表2 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

表3 樣品亞硝酸鹽濃度和含量比較

本實(shí)驗(yàn)采用亞鐵氰化鉀與乙酸鋅反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅吸附茶中蛋白質(zhì)共沉淀，再經(jīng)定容、靜置、干過(guò)濾去除蛋白質(zhì)。

采取重氮偶合反應(yīng)法測(cè)定提取液中亞硝酸鹽含量，其原理是在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮鹽再與二鹽酸-1-萘乙二胺偶合生成紫紅色偶氮化合物[2,9]。

亞硝酸鹽傳統(tǒng)的提取和檢測(cè)方法大多用于蔬菜、肉制品、腌菜等樣本的檢測(cè)，其提取液的顏色較清澈，檢測(cè)過(guò)程中并沒(méi)有考慮色素的干擾問(wèn)題，即使脫色，大多是使用活性炭[4,10]。由于茶葉中含有多酚類化合物和茶色素等特殊的成分[2]，所以不同提取液的顏色也深淺不一，這些色素的存在對(duì)吸光度有較大影響而干擾檢測(cè)結(jié)果。因此，用比色法測(cè)定茶葉中的亞硝酸鹽含量時(shí)，去除樣品濾液中色素的干擾十分重要。依據(jù)高海榮等[11]的報(bào)道，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在超聲萃取并凈化后的濾液中加入堿式乙酸鉛可以達(dá)到良好的脫色效果，優(yōu)于活性炭，并摸索出堿式乙酸鉛的加入量。凈化后的濾液經(jīng)堿式乙酸鉛脫色后，再采用重氮偶合光度法測(cè)定提取液中的亞硝酸鹽含量，提高了亞硝酸鹽測(cè)定的準(zhǔn)確度。該脫色處理方法原理在于堿式乙酸鉛在水溶液中能與黃酮類化合物等水溶性色素生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，并通過(guò)在濾液中加入硫酸溶液除去過(guò)量堿式乙酸鉛，同時(shí)保證溶液在酸性的條件下完成重氮偶合顯色[2]。

本實(shí)驗(yàn)探索并建立了超聲萃取-重氮偶合光度法快速檢測(cè)茶葉中亞硝酸鹽含量的檢測(cè)方法，可為廠家改進(jìn)生產(chǎn)方法和行業(yè)人員快速檢測(cè)提供參考。