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    棉花遺傳多樣性分析SSR標記的快速預(yù)篩

    2019-05-15 09:13:32姜輝王永翠高明偉王秀麗陳瑩王家寶柴啟超張超趙軍勝
    中國棉花 2019年4期
    關(guān)鍵詞:種質(zhì)多態(tài)性棉花

    姜輝,王永翠,高明偉,王秀麗,陳瑩,王家寶,柴啟超,張超,趙軍勝

    (山東棉花研究中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點試驗室,濟南 250100)

    遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源評價的重要方面,可為育種家在種質(zhì)創(chuàng)新和親本選配過程中提供有力參考,使雜交親本的選擇更有針對性,能極大提高雜交后代育種選擇效率。在眾多用于遺傳多樣性分析的標記中,DNA 分子標記作為不受環(huán)境影響的中性標記,應(yīng)用最為廣泛,基于DNA 分子標記的分析方法成為種質(zhì)資源遺傳背景評價分析的重要手段[1-3]。其中,微衛(wèi)星標記(Simple sequence repeat,SSR)因具有易開發(fā)、多態(tài)性好、操作簡單、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析[4-14]。棉花分子標記數(shù)據(jù)庫CMD(Cotton Marker Database) 曾經(jīng)公布的棉花SSR 標記有17 448個;陸地棉測序后,南京農(nóng)業(yè)大學棉花所公布了77 996個棉花基因組SSR 標記[15],均為棉花種質(zhì)的遺傳多樣性分析提供了大量的分子標記。但研究表明,棉花遺傳基礎(chǔ)相對狹窄,大量SSR標記在種質(zhì)資源中無多態(tài)性或者多態(tài)性較低[16-23]。在大量分子標記中快速高效地篩選出多態(tài)性較好的分子標記,是基于SSR 標記分析遺傳多樣性的基礎(chǔ),對提高棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析效率具有重要意義。

    本研究擬對改良DNA 混合池法在棉花種質(zhì)遺傳多樣性分析SSR 標記快速篩選中的應(yīng)用進行探討,并對篩選標記的使用效果進行初步驗證,為棉花種質(zhì)親緣關(guān)系分析過程中多態(tài)性SSR 標記的快速篩選提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    60個棉花基因組SSR 標記從CMD 網(wǎng)站下載的文件中隨機挑選,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;40 份不同的棉花種質(zhì)材料由山東棉花研究中心遺傳育種室保存提供。

    1.2 方法

    1.2.1DNA 混池的制作。將40 份種質(zhì)隨機排列,編號1~40。5個樣品1個混池,混池編號依次為P1~P8,P1包含材料1~5,P2包含材料6~10,依次類推;每個混合池的第1 樣品作為各自的對照。

    1.2.2DNA 提取及聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)。棉花基因組DNA 提取方法參照文獻[24];PCR 反應(yīng)體系為10 μL,包括Promega 5×Green buffer 2 μL,10 μmol·L-1dNTPs 0.5 μL,DNA 模板0.5 μL,正向和反向引物各0.5 μL,DNA 聚合酶0.5 μL,ddH2O 5.5 μL;PCR 在T100 型梯度PCR 儀(美國伯樂公司)上運行,程序為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,30個循環(huán),72 ℃后延伸10 min,12 ℃保存。

    1.2.3多態(tài)性標記的選擇。PCR 產(chǎn)物在8%(質(zhì)量分數(shù))的聚丙烯酰胺凝膠上分離,并用快速銀染法染色。比較混合池與對照間的差異,將差異標記進一步用于單樣品的多態(tài)性分析。

    1.2.4帶型判讀及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)標記帶型進行統(tǒng)計,陽性帶型為1,陰性帶型為0,遺傳多樣性分析軟件為NTsys2.0。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分子標記多態(tài)性篩選

    經(jīng)過DNA 混合池篩選,不同分子標記在混合池間的差異表現(xiàn)不同。在60個SSR 標記中,20個分子標記在8個混池之間表現(xiàn)出差異(表1),所占比例為33.3%。多態(tài)性標記在混池中差異不盡相同,其中BNL1053、MON5553 等7個標記在8個混合池內(nèi)都表現(xiàn)出差異;MON0613、BNL3031、BNL827 等6個標記在7個混合池中表現(xiàn)出差異;而MON0362 和MON296 僅在3個混池中表現(xiàn)出差異。

    2.2 分子標記多態(tài)性驗證

    為檢驗該混合池法篩選差異SSR 分子標記的可靠性,用60個標記分別對40個樣品單樣進行PCR 檢測,結(jié)果顯示,對于20個有差異的標記而言,單樣品檢測中均表現(xiàn)出不同程度的差異,參見圖1(BNL2449 在8個混池中的標記帶型)和圖2(BNL2449 在部分單樣品的標記帶型)。對于40個在8個混合池間及對照間沒有表現(xiàn)出差異的標記而言,在單樣品的檢測中也沒有發(fā)現(xiàn)差異,參見圖3和圖4(BNL3264 在混池和單樣品中的檢測結(jié)果)。

    表1 20個多態(tài)性SSR 標記在8個混合池中的多態(tài)性表現(xiàn)

    圖1 BNL2449 在混池間的標記帶型

    圖2 BNL2449 在部分單樣品的標記帶型

    圖3 BNL3264 在混池間的標記帶型

    圖4 BNL3264 在部分單樣品的標記帶型

    2.3 混池篩選的分子標記對遺傳多樣性分析的影響

    為了驗證混合池篩選出的標記在遺傳多樣性中分析的效果,分別挑選了在混合池篩選中差異較大的5個標記BNL1053、MON5553、MON022、NAU1043、NAU2083 和差異較小的5個標記MON296、MON0362、NON0707、NAU802 和NAU808,根據(jù)2組標記在40樣品中的多態(tài)性數(shù)據(jù),用NTsys 軟件進行了聚類分析,結(jié)果如圖5和圖6所示。結(jié)果顯示圖5在遺傳相似系數(shù)為0.68時可以明顯地將40份材料分為3 類,而圖6中遺傳相似系數(shù)為0.78時,40份材料才分成兩大類,并有很大一部分種質(zhì)材料無差異,這說明在遺傳多樣性分析中可優(yōu)先選擇在混合池中差異較大的標記用于種質(zhì)的遺傳多樣性評價。

    3 討論與結(jié)論

    基于SSR 標記的遺傳多樣性分析中,標記多態(tài)性是無法預(yù)判的,只能通過單樣品檢測才能了解,而且有關(guān)提高棉花SSR 標記篩選效率方法的研究較少。王欣怡等[20]提出通過查閱系譜,找出8份親緣關(guān)系較遠的材料對586 對候選引物進行初篩,得到190 對初篩引物,用于下一步的遺傳多樣性分析。這種方法雖然在一定程度上提高了多態(tài)性標記的預(yù)篩效率,但是需要了解部分種質(zhì)的系譜信息,這極大限制了其用于系譜信息不全的種質(zhì)的分析。此外,基于部分種質(zhì)的預(yù)篩會遺漏大部分遺傳信息。本研究將改良DNA 混池法用于遺傳多樣性標記的預(yù)篩,包含了所有分析材料的遺傳信息。結(jié)果表明,該法可有效提高棉花SSR 標記的篩選效率,可以在相對較短的時間內(nèi)將多態(tài)性較好的標記用于遺傳多樣性分析當中,同時極大降低試驗成本。

    圖5 基于多態(tài)性較好的SSR 標記的遺傳聚類分析

    圖6 基于多態(tài)性較差的SSR 標記的遺傳聚類分析

    雖然混池法可提高標記的預(yù)篩效率[25],但在不加對照的情況下,無法顯示池內(nèi)的多態(tài)性,只能根據(jù)混池之間的帶型不同選擇標記,容易丟失部分多態(tài)性標記。本研究提出嘗試在DNA 混合池構(gòu)建過程中,每個池選擇1個隨機對照,通過增加不同對照,減少多態(tài)性標記漏篩的概率。通過本研究的驗證,經(jīng)過不同混合池與不同對照的兩兩比對,可有效提高多態(tài)性標記的預(yù)篩效率。如圖1 所示,以P2和P3 為例,通過各自的對照6 和11,可知2個混池內(nèi)均具有多態(tài)性。池內(nèi)多態(tài)性越好的標記,其分析效果越好。

    本試驗由于所用的材料相對較少,因此采用5個樣品混池的方法。在實際應(yīng)用時,可針對試驗材料數(shù)量的不同,對每個混池中的樣品數(shù)量進行調(diào)整。此外,本方法的反應(yīng)條件還需要進一步優(yōu)化。

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