煙草黑脛病拮抗菌XA-1的篩選?鑒定及其抑制作用研究

李娜 陳勝 程書鋒 祃志明 彭建

摘要[目的]有效預防和控制恩施種植區(qū)域煙草黑脛病害。[方法]通過表面消毒分離、平板共培養(yǎng)、分子生物學鑒定、室內盆栽方法篩選、鑒定及評價菌株抑制活性。[結果]從恩施健康煙草植株中分離篩選出一株對煙草黑脛病病原菌有顯著拮抗活性的菌株XA-1，該菌株的胞外分泌物對病原菌菌絲有強烈的抑制作用，通過Biolog微生物系統(tǒng)和分子生物學分析，初步鑒定該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliauefaciens），經室內盆栽試驗評價，拮抗菌XA-1能有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，在第20天時相對防效最高為52.38%。[結論]菌株XA-1在防治煙草黑脛病方面效果明顯，具有潛在的生物防治應用價值。

關鍵詞煙草黑脛病;生物防治;解淀粉芽孢桿菌

中圖分類號S435.72文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0123-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

由煙草疫霉變種（PhytophoranicotianaBredadeHaan）引起的煙草黑脛病給煙草種植帶來毀滅性破壞，病害植株生長緩慢，嚴重的甚至全株死亡[1-2]。煙草黑脛病作為一種土傳病害，到目前為止尚無行之有效的防治措施，煙草黑脛病在種植上采取綜合防治措施，包括種植抗病品種、農業(yè)防治、病害發(fā)生期的藥劑防治，以及生物防治和植物誘導抗性的利用等。目前，煙草種植上用來防治煙草黑脛病的化學藥劑多為甲霜靈、乙磷鋁等殺菌劑，長期重復使用使煙草黑脛病菌產生了一定的抗藥性[3]，而且會造成一定農藥殘留。

近年來，煙草及煙草制品逐漸向安全化方向發(fā)展，對煙草質量的要求越來越高，因而，發(fā)展安全性高的拮抗微生物來防治煙草病害非常迫切。拮抗細菌在植物土傳病害防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢：細菌對病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭、拮抗以及寄生、誘導植物產生抗性等方式對病原菌產生影響;細菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和周圍土壤大量存在;細菌繁殖速度非?？?許多細菌存在于植物根際和地上部，對植物生態(tài)比較適宜;細菌大多可以人工培養(yǎng)，便于控制，在實踐中易于操作;有些細菌不僅能防治病害而且可以增加作物產量。國內外研究者已從各種樣品中篩選出多種對煙草黑脛病具有良好拮抗效果的生防菌株，為煙草黑脛病的生物防治提供了豐富的種質資源[4-6]。國內外已報道的生防菌主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）、假單孢菌（Pseudomonasspp.）和放線菌。Fravel等[7]報道過一株B.cereussubsp，在煙草幼苗生物測定試驗中能抑制黑脛病菌游動孢子對煙草幼苗的侵染。筆者主要針對恩施煙草種植區(qū)域的病害防治，從煙草黑脛病發(fā)病田塊選取健康植株，采用表面消毒殺菌法從其根系中分離和篩選高效拮抗菌株，從中篩選效果最好的一個菌株進行相關生物學鑒定，研究該拮抗菌株的分類地位、生物學特性和抗菌活性物質。同時以微生物有機肥為載體，通過室內盆栽試驗考察拮抗菌對煙草黑脛病的控制作用，旨在為開發(fā)土壤微生物資源、減少化學農藥使用、發(fā)展基于有機肥的土傳病害生物防治技術提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

煙草疫霉變種（Phytophthoravar.nicotianae）;白肋煙B21（感黑脛病品種，湖北省煙草科研所提供）;NB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水1000mL，滅菌前pH7.2～7.4。燕麥片30.0g/L，跡量鹽1mL（FeSO40.1g，MnCl20.1g，ZnSO40.1g，蒸餾水100mL），瓊脂粉18.0g/L，蒸餾水1000mL，滅菌前pH7.2。Waksman培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，瓊脂18.0g/L，pH6.8。盆栽器具（均購自武漢市花卉市場）：花卉培養(yǎng)土，富含N、P、K和微量元素，pH5.6～6.0;育苗穴盤和花盆等。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株分離與篩選。

分別從恩施咸豐縣、盛家壩和下云壩等煙草黑脛病高發(fā)田塊選擇健康煙株取樣，樣品分為兩類收集：①病害嚴重田塊的健康植株;②相鄰不發(fā)病田塊的健康植株。樣品編號后放置5℃冰箱保存?zhèn)溆?。煙根用自來水沖洗干凈后，稱取10g置于無菌平皿中，加入75%乙醇浸泡1min后，再轉入1%次氯酸鈉溶液中浸泡10min，處理后用無菌水漂洗3～5次，表面消毒后的煙根用滅菌解剖剪剪成約0.5mm的片段，將根片段加入到90mL裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，150r/min振蕩30min，取出上清液分別稀釋至10-3、10-4、10-5，移取100μL涂布于Waksman平板上。此外再移取最后一次漂洗的無菌水100μL涂布于平板上，作為檢驗表面消毒是否徹底的參照[8]。所有分離平板在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48h，根據(jù)不同菌落形態(tài)特征挑取單菌落，然后轉接至Waksman斜面上保存。

平板共培養(yǎng)初篩[9]：煙草疫霉變種在CA平板上活化后，用0.5mm的打孔器從菌落邊緣取下新鮮菌餅，接入Waksman平板中心做指示菌，用接種環(huán)挑取分離純培養(yǎng)物在距離菌餅3cm處接種，每個菌株做3次重復，以僅接種病原真菌菌塊而未接種測試菌的作為對照。所有測試菌株放置在30℃培養(yǎng)約7d，對照平板菌落長滿后，測量對照病原菌菌落直徑（R1）及與拮抗菌對峙的煙草疫霉直徑（R2），按照以下公式計算抑菌直徑和抑菌率。

抑菌直徑=R1-R2，抑菌率=（R1-R2）/R1×100%

復篩：將初篩拮抗效果好的菌株接種至裝有30mL液體NB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃恒溫和轉速180r/min的回轉式搖床中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)物在10000r/min條件下常溫離心5min，離心后除去沉淀收集上清液，上清液用無菌過濾器（0.22μm孔徑的濾膜）過濾除菌備用，在平板中心接種指示菌，并在距離指示菌3cm處打孔添加25μL發(fā)酵上清液，每個3次重復，以不添加濾液的CA平板作為對照。然后放置30℃培養(yǎng)箱中約7d后測量菌落直徑并計算抑菌率[10]。

1.2.2Biolog微生物系統(tǒng)和16SrDNA分子生物學鑒定。

待測菌株經芽胞染色和革蘭氏染色后，確定菌株類型和合適培養(yǎng)基。從菌株保存斜面挑取菌落在BUY培養(yǎng)基平板劃線，平板放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。用滅菌棉簽挑取已經培養(yǎng)好的菌落，在無菌狀態(tài)下接種至濁度管中。用空白調至100%，用標準液管調至指定刻度。再用接種后的濁度管進行測量，用無菌水不斷調整濁度的大小，達到以上標準濁度值。將制備好的菌懸液倒人加樣槽中，使用八道電動移液器，將其接種于微平板的96孔中。微平板在28℃生化培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)第6天和第1天后，將微平板放入讀數(shù)儀測定反應結果，根據(jù)Microlog軟件進行結果分析。

提取菌株基因組DNA為模板，以上游引物GACGAGTGGCGGACGGGTG（27F）和下游引物CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG（1492R）進行PCR擴增。純化后的產物測序由北京奧科生物技術有限責任公司的ABI3730XL自動測序儀完成。得到菌株的16SrDNA基因測序結果后，用NCBI的Blast軟件進行序列相似性分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫和核糖體數(shù)據(jù)庫選取相近種屬代表性菌株的16SrDNA基因序列，通過Clustal1.8和MEGA4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用鄰接法（Neighborjoining）構建16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，用于檢驗自舉支持率（Bootstrap）的重復抽樣次數(shù)為1000次[11]。

1.2.3室內盆栽試驗。

煙草疫霉變種在CA平板上培養(yǎng)7d后加入0.1%KNO3溶液浸泡，在5℃低溫冰箱放置30min后加入10mL1%的葡萄糖，收集孢子液后采用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子濃度調為105CFU/mL備用[12]。取拮抗菌發(fā)酵液1L，離心（轉速為6000r/min）除去上清液，測定芽孢單位含量（CFU/g），然后按一定比例與麩皮混合均勻，調整菌劑芽孢含量為107CFU/g。白肋煙B21種子經表面消毒后催芽、播種，培養(yǎng)至第10片真葉展開，移至盆缽，盆缽置于溫室中，溫室條件為溫度25℃～30℃、濕度70%～80%、16h/d光照（日光燈，800lx）。溫室盆栽試驗設置4個處理：①空白對照（不接種）;②接種病原菌;③接種拮抗菌XA-1，48h后接種病原菌;④接種拮抗菌XS-2，48h后接種病原菌。每個處理30株煙。以株為單位分級調查，煙草黑脛病病情指數(shù)分為5個等級：0級，全株無病;1級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎;3級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑;5級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎;7級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎。統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，計算相對防治效果，病情指數(shù)及防治效果計算公式：

發(fā)病率=n/N×100%

其中，n為發(fā)病株數(shù)，N為調查總株數(shù)。

病情指數(shù)=（i×ni）/（H×N）×100%

其中，ni表示i病情下發(fā)病株數(shù)，H表示最高病情代表值，N表示調查總株數(shù)。

相對防效=（FCK-Ft）/FCK×100%

其中，F(xiàn)CK表示空白組病情指數(shù)，F(xiàn)t表示處理組病情指數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析采用Minitab10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用SPSS18.0軟件進行顯著差異性（P<0.05）分析。

47卷1期李娜等煙草黑脛病拮抗菌XA-1的篩選·鑒定及其抑制作用研究

2結果與分析

2.1拮抗菌的篩選

從恩施咸豐縣、盛家壩和下云壩采集健康煙株樣品20份，采用表面消毒殺菌法從根部共分離73株細菌，通過對峙平板篩選，發(fā)現(xiàn)拮抗效果較好的有7株（表1），其中菌株XA-1抑菌效果最佳，對煙草黑脛病菌的抑菌直徑大于10mm，抑菌率達65.23%。菌株XA-1胞外代謝粗提液表現(xiàn)出較好的抑制作用（圖1），對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制率達82.52%，表明菌株XA-1抑菌物質為胞外代謝分泌物。

2.2菌株XA-1的鑒定

根據(jù)96孔板的反應結果，顯示10個可能的ID，如果10個SIM值的總和大于0.5時，系統(tǒng)給出的鑒定結果ID是一個屬名，菌株XA-1的10個ID值總和為0.595，XA-1屬于芽孢桿菌屬（圖2）。將菌株XA-1的16SrDNA基因序列提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，得到序列號為JX069970，將核酸序列進行同源性比對（Blast）后結果顯示，菌株XA-1與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42（CP000560）的相似性達99.73%。選取同源性97%以上相近種屬菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株XA-1與解淀粉芽孢桿菌屬于同一個聚類，初步鑒定為Bacillusamyloliquefacienssubsp。

2.3生防菌株的盆栽試驗

由表2可知，對照組和處理組均隨著發(fā)病時間的延長病情指數(shù)不斷提高。當盆栽時間為60d時，對照組發(fā)病率達66.67%，從防治效果看，對于人工

主動接種煙草疫霉變種的煙草植株，在施用濃度107CFU/mL的拮抗菌后，可以有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，其中XA-1在第20天時相對防效最高為52.38%。由圖3可知，XA-1菌處理組病情指數(shù)顯著低于CK和XS-2處理組，其中在第20天后，相比對照，XA-1菌處理組病情指數(shù)下降，因此拮抗菌XA-1具備生物防治的潛力，可以做進一步的研究。然而拮抗菌相對防治效果的整體趨勢下降，一方面可能是煙草B21屬于易感品種，病原菌孢子成功侵入植株后，在植株體內存在特定的庇護場所而不會受到拮抗菌的影響[13];另一方面可能是拮抗菌在煙草根部的數(shù)量減少，如需進一步驗證，需要采用分子生物學技術考察拮抗菌在煙草根系中的定殖能力。

3結論與討論

該研究從健康煙草根部分離篩選得到1株對煙草黑脛病菌拮抗活性較好的細菌XA-1。菌株XA-1分泌的胞外次生代謝產物對黑脛病菌絲有很強的抑制效果，一方面與發(fā)酵液中活性物質能夠抑制病原菌正常生長的菌體蛋白的合成有關，另一方面與拮抗菌產生的某些溶菌酶有關[14]。經Biolog微生物和分子生物學分類鑒定，菌株XA-1初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliauefaciens。溫室盆栽試驗結果表明，拮抗菌XA-1可有效地降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，在第20天時相對防效最高為52.38%，因此拮抗菌XA-1具備生物防治的潛力。

在防治經濟作物的土傳病害過程中，生防研究為經濟作物病害管理系統(tǒng)提供新的手段。農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要必然會減少化學殺蟲劑的施用量，低毒、無害、綠色、環(huán)保的生防菌劑將成為化學殺蟲劑的替代產品。芽孢桿菌屬細菌好氧或兼性厭氧，營腐生生活，生理特征多樣化，抗逆性強，繁殖快，營養(yǎng)簡單，適生性強。其突出的特征是產生耐熱抗逆的內生芽孢，這有利于生防菌劑（Biologicalcontrolagent

BCA）的生產、加工和保存，也有利于菌體在環(huán)境中存活與

定殖[15]。Elliott等[16]考察了4種生防菌劑和化學農藥在棉花和扁豆應用中的可靠性和穩(wěn)定性。田間試驗效果表明，芽孢桿菌菌劑在不同植物和不同年份比非芽孢桿菌菌劑穩(wěn)定并能發(fā)揮長期的效用，而且可以與化學農藥混合使用。

從理論上講，任何能夠降低植物病原微生物數(shù)量或致病性的微生物都屬于生物防治的微生物資源，從豐富的微生物資源篩選出高效的拮抗菌是生物防治技術成功的關鍵。該研究從煙草植株中分離篩選的菌株XA-1對煙草黑脛病原菌有較高的拮抗性，具有潛在的應用前景。然而一種生防菌劑從實驗室到田間推廣是一個極其復雜的過程，該研究僅對XA-1菌株的分離鑒定、拮抗活性及室內盆栽效果進行研究，要最終實現(xiàn)田間推廣應用，仍需借助分子生物學相關技術，了解菌株在煙株中的定殖情況和動態(tài)變化。

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