堿燒傷誘導(dǎo)兔部分性角膜緣干細(xì)胞失代償模型

高晴琴, 王 平, 王 娟, 孫 明, 徐玲娟, 王 瑋, 朱 暉, 江夢琳, 胡維琨, 李新宇, 李貴剛

0引言

角膜上皮位于正常角膜的最表層，是保護(hù)角膜免受病原體侵害的重要屏障，對保持角膜的完整和透明性至關(guān)重要。角膜上皮由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞組成，一生都處于不斷地更新保持動態(tài)平衡狀態(tài)[1]。正常角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSC)是維持角膜上皮更新的必備條件。LSC可以分裂為兩種細(xì)胞，一種是新一代的LSC細(xì)胞，維持恒定的干細(xì)胞群，這個過程被稱為自我更新(self-renew)；另一種是瞬時擴(kuò)增細(xì)胞(transit amplifying cells，TAC)，這一過程被稱為分化(differentiation)，TAC細(xì)胞具有旺盛的分裂增殖能力，向角膜中央不斷移行，以填充角膜上皮的基底層，這些基底細(xì)胞可以持續(xù)分裂或進(jìn)入細(xì)胞周期，形成角膜基底層上皮細(xì)胞和成熟的表層上皮細(xì)胞[2-3]。各種原因都會造成LSC的損傷，從而導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞失代償(limbal stem cell deficiency，LSCD)，如化學(xué)或熱燒傷，Stevens Johnson綜合征、Sj?gren綜合征及其他眼表慢性炎癥。LSCD可以導(dǎo)致角膜上皮遷延不愈、角膜上皮結(jié)膜化、角膜新生血管、角膜混濁等病理改變，從而嚴(yán)重影響患者視力乃至致盲，并且成為同種異體角膜移植失敗的重要原因。

近年來，許多研究小組運用各種動物、不同方法制作LSCD模型，用以研究LSCD發(fā)生機(jī)制，并期望尋找治療這一疾病的最佳方法，LSCD模型的制作是這類相關(guān)研究的基礎(chǔ)。本研究采用去除兔第三眼瞼的方法，有效利用了顳上方角膜結(jié)膜容易暴露觀察的特點，記錄了一組采用堿燒傷誘導(dǎo)兔部分性LSCD的動物模型制作新方法，現(xiàn)報告如下。

1材料和方法

1.1材料選取30只眼部健康的C57小鼠、19只眼部健康新西蘭白兔、1mol/L KOH溶液(0.56g KOH溶于10mL去離子水中配制而成)、濾紙、氯胺酮、0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液、生理鹽水、0.5%鹽酸左氧氟沙星滴眼液、醋酸纖維素微孔濾膜、4%多聚甲醛、Schiff氏溶液、蘇木素染液、亞硫酸鈉溶液、PBS液、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、蒸餾水、1%鹽酸酒精、二甲苯、伊紅染液。

1.2方法本研究由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會審核通過,并遵守實驗動物操作倫理學(xué)規(guī)定。

1.2.1小鼠完全性LSCD模型制作方法根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法[4]，小鼠中央角膜堿燒傷誘導(dǎo)LSCD。C57小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液，每分鐘1次合計3次表面麻醉。取直徑3mm圓形濾紙片置于1mol/L氫氧化鉀溶液中浸潤，用鑷子夾取濾紙片，在一張新的濾紙上吸掉多余的液體，置于左眼中央角膜表面與角膜緊密貼敷，燒灼30s，用20mL生理鹽水充分沖洗(圖1A)。右眼不做燒灼，作為正常對照。

1.2.2兔部分性LSCD模型制作方法新西蘭白兔肌肉注射氯胺酮(35mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%鹽酸奧布卡因滴眼液，每分鐘1次合計3次表面麻醉，剪刀去除兔眼瞬膜(第三眼瞼)，取直徑5mm圓形濾紙片置于1mol/L氫氧化鉀溶液中浸潤，將浸濕的濾紙片置于顳上方角膜表面，30s后立即用生理鹽水沖洗(圖1B)，右眼作為正常對照。

1.2.3角膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查方法兔結(jié)膜囊內(nèi)滴0.25%鹽酸奧布卡因1滴，等待2min后用濾紙吸去多余淚液,顯微無齒鑷夾取己消毒的醋酸纖維素薄膜濾紙(預(yù)先裁剪為高約4mm的三角形)，將三角尖對角膜，底邊對結(jié)膜，粗糙面貼于球結(jié)膜、病變角膜及透明角膜處，稍加壓10s，印取表層上皮細(xì)胞，將濾紙片置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定好的樣品采用PAS染色(periodic acid-schiff stain)之后放置于顯微鏡下觀察。

圖1 角膜堿燒傷法誘導(dǎo)LSCD示意圖 白色區(qū)域為角膜表面濾紙片燒灼部位，采用1mol/L氫氧化鉀溶液浸泡濾紙片燒灼30s，再用生理鹽水沖洗干凈 A：C57小鼠，濾紙片直徑3mm；B：新西蘭白兔，濾紙片直徑5mm。T：顳側(cè)N：鼻側(cè)。

圖2 鼠完全性LSCD模型不同階段前段照相及2mo病理切片 A：正常小鼠角膜；B：小鼠角膜堿燒傷后2wk；C：小鼠角膜堿燒傷后2wk，角膜混濁，新生血管長入；D：小鼠角膜堿燒傷后1wk，角膜穿孔；E：堿燒傷2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，上皮層可見大量杯狀細(xì)胞(×400)；F：堿燒傷2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，基質(zhì)層可見大量新生血管(×400)。

1.2.4 HE染色方法對取得的角膜組織進(jìn)行石蠟包埋、切片后用二甲苯進(jìn)行脫蠟，隨后分別用無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇以及蒸餾水進(jìn)行復(fù)水，用蘇木素染液進(jìn)行細(xì)胞核染色之后再用伊紅染液進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色，隨后分別用70%的乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇進(jìn)行脫水，將脫水后的切片放入二甲苯中浸泡使切片透明，最后用快干膠將切片封固，置于顯微鏡下觀察。

1.2.5觀察指標(biāo)小鼠及白兔角膜堿燒傷后雙眼滴用0.5%鹽酸左氧氟沙星滴眼液，4次/d。術(shù)前、術(shù)后1、2、4wk,2mo采用裂隙燈顯微鏡觀察、攝像，觀察角膜上皮愈合時間，記錄角膜潰瘍、穿孔等并發(fā)癥。術(shù)后2mo處死小鼠，角結(jié)膜切片檢測角膜新生血管分布情況。計算堿燒傷誘導(dǎo)鼠完全性LSCD模型成功率。術(shù)后2mo采用印跡細(xì)胞學(xué)檢測兔眼表杯狀細(xì)胞分布(正常角膜區(qū)域、LSCD角膜區(qū)域、結(jié)膜)。處死動物，角結(jié)膜切片觀察角膜新生血管、杯狀細(xì)胞密度。計算利用堿燒傷誘導(dǎo)兔部分性LSCD模型成功率。

LSCD的診斷標(biāo)準(zhǔn): (1)裂隙燈檢查見全部或部分角膜緣正常結(jié)構(gòu)喪失、角膜新生血管。(2)角膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查可見杯狀細(xì)胞[5-7]。

2結(jié)果

角膜堿燒傷后觀察2mo，30只小鼠中，6只因麻醉意外死亡，2只分別在第7d和第14d出現(xiàn)了角膜穿孔，其余 22只小鼠發(fā)生不同程度完全性LSCD，誘導(dǎo)成功率92%，表現(xiàn)為角膜新生血管、角膜混濁。19只白兔，其中7只因麻醉意外死亡，12只白兔造模成功,誘導(dǎo)成功率100%，在觀察過程中，未出現(xiàn)角膜穿孔的情況。兩種方法造模成功率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.543)。

正常小鼠結(jié)膜無充血，角膜透明，角膜緣血管網(wǎng)清晰可見，通過透明的角膜，可以清晰顯示虹膜紋理、瞳孔大小、晶狀體透明(圖2A)。角膜中央堿燒傷后2wk，部分小鼠LSCD程度適中，表現(xiàn)為無明顯充血，中等程度角膜新生血管，纖維血管膜長入角膜，中央角膜混濁，無法透過角膜看清虹膜及瞳孔情況，這是比較理想的LSCD模型(圖2B)。角膜中央堿燒傷后2wk，部分小鼠LSCD程度嚴(yán)重，表現(xiàn)為睫狀充血+++，大量角膜新生血管，中央角膜潰瘍，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況，這種LSCD很難治愈，不是理想的LSCD模型(圖2C)。角膜中央堿燒傷后1wk，部分小鼠角膜潰瘍穿孔，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況，這種被判定為LSCD模型制作失敗，無法用于進(jìn)一步的LSCD治療模型(圖2D)。堿燒傷后2mo，小鼠角膜病理切片HE染色可見角膜上皮杯狀細(xì)胞長入(圖2E)，基質(zhì)有大量新生血管(圖2F)。

圖3 兔部分性LSCD模型不同階段前段照相和印記細(xì)胞學(xué)PAS染色及病理切片 A、E：堿燒傷后1wk；B、F：堿燒傷后2wk；C、G：堿燒傷后1mo；D、H：堿燒傷后2mo；I：堿燒傷后2mo兔部分性LSCD模型正常角膜部分印跡細(xì)胞學(xué)PAS染色陰性(×400)；J：堿燒傷后2mo病變角膜印跡細(xì)胞學(xué)PAS染色顯示大量杯狀細(xì)胞(×400)；K：堿燒傷后2mo角膜切片HE染色，上皮層可見大量杯狀細(xì)胞(×200)；L：堿燒傷后2mo角膜切片HE染色，基質(zhì)層可見大量新生血管(×200)。

兔角膜堿燒傷后1wk，表現(xiàn)為輕度角膜新生血管，尚未見纖維血管膜長入角膜，角膜燒傷局部混濁明顯，無法透過角膜看清虹膜及瞳孔情況，其他部位可透過角膜看清虹膜及瞳孔紋理(圖3A)，燒傷局部角膜上皮熒光素鈉染色陽性(圖3E)。兔角膜堿燒傷后2wk，LSCD程度適中，表現(xiàn)為中等程度角膜新生血管，纖維血管膜長入角膜，燒傷局部角膜混濁明顯，其他部位角膜輕度混濁，可隱約窺見虹膜及瞳孔紋理(圖3B)，角膜熒光素鈉染色見局部角膜上皮缺損范圍增大(圖3F)。角膜堿燒傷后1mo，表現(xiàn)為角膜大量新生血管，角膜混濁加重，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況(圖3C)，角膜熒光素鈉染色可見大片上皮缺損(圖3G)。角膜堿燒傷后2mo，結(jié)膜無充血，角膜上皮愈合，新生血管減少，角膜混濁，無法透過角膜看到虹膜及瞳孔情況(圖3D)，角膜熒光素鈉染色陰性(圖3H)。透明角膜部位印跡細(xì)胞學(xué)PAS染色未見杯狀細(xì)胞(圖3I)，混濁角膜部位可見大量杯狀細(xì)胞(圖3J)。角膜病理切片HE染色可見角膜上皮杯狀細(xì)胞長入(圖3K)，基質(zhì)新生血管主要位于淺層(圖3L)。堿燒傷后2mo，2只白兔角膜新生血管累及2個象限，其余10只白兔均僅累及1個象限，平均累及1.17±0.39個象限。在高倍鏡(HP,×400)下對12只兔部分性LSCD模型的角膜杯狀細(xì)胞計數(shù)，平均角膜杯狀細(xì)胞數(shù)為58.60±12.58個細(xì)胞/HP。

3討論

3.1模型動物選擇兔還是小鼠用于制作LSCD模型的動物大多選用兔[8-27]和小鼠[4-5,28-29]，兔眼大小更接近人眼，與小鼠相比角膜面積更大，因此有利于模型成功和手術(shù)操作。且兔子性情溫順，極少傷人，在制作LSCD模型時更易操作、更易觀察，拍攝照片時也更加清晰。Ti等[11]在完全性LSCD兔模型上觀察到鼻側(cè)的新生血管多于其他方向，認(rèn)為兔眨眼速度慢，且存在瞬膜，會對眼表施加額外的摩擦力，尤其是鼻側(cè)。瞬膜的存在可能會影響堿燒傷的操作和日常的角膜病變觀察記錄。因此我們選擇去除兔眼的瞬膜，這樣在觀察和拍照的時候就可以不受此影響。小鼠的眼球較小，進(jìn)行操作、測量新生血管面積及照相的難度都較兔子大，但小鼠可供選擇的抗體較兔子齊全，有利于在同類研究中的比較。因此兩種動物模型各有優(yōu)缺點。

3.2完全性LSCD模型還是部分性LSCD模型就近幾年的研究來看，制作完全性LSCD模型[5,8,11-15,18,20-25,28-29]的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于部分性[9-10,16-17,19]。但是這種研究模型在檢驗治療方法的有效性的時候有一定局限性，因為合并嚴(yán)重的角膜病變，無論是研究組還是陽性對照的治療方法都不容易獲得治愈效果，或者治療效果不顯著，這樣就難以做出治療方法的優(yōu)劣性判斷。角膜化學(xué)傷誘導(dǎo)LSCD，目前報道的均為完全性LSCD，往往合并嚴(yán)重的角膜混濁、深層新生血管等病變。由于中央角膜堿燒傷損傷范圍大，容易發(fā)生角膜潰瘍不愈合、角膜穿孔而導(dǎo)致造模失敗。Ma等[4]在研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重建鼠化學(xué)燒傷眼表時發(fā)現(xiàn)，80只鼠在化學(xué)燒傷1wk后有29只(36%)因出現(xiàn)了嚴(yán)重的前房積血、前房積膿、角膜穿孔而退出研究。郭濱等[27]運用不同堿燒傷方法制作兔完全性LSCD模型時A組兔眼由于NaOH在角膜緣停留時間過長，6只眼全部出現(xiàn)角膜穿孔、眼球萎縮而造模失?。籅、C組造模成功但B組因為在結(jié)膜囊滴入NaOH而導(dǎo)致瞼球粘連。瞼球粘連并非是LSCD的必要體征，且不利于后期進(jìn)行LSCD治療方法的相關(guān)研究。相反，如果LSCD動物模型的損傷比較局限于表層組織，那么治療方法容易取得眼表健康改善、視覺改善等陽性指標(biāo)，并與對照組形成比較明顯的對比，從而發(fā)現(xiàn)有用的治療方法，并且客觀定量評價治療效果。

此外，由于動物角膜暴露困難，完全性LSCD模型不便于觀察和照相，以及印跡細(xì)胞學(xué)檢查等操作。而部分性LSCD模型更便于觀察，前段照相時兔配合情況好，燒傷操作時更易精確控制部位和時間，成功率高。在研究LSCD微環(huán)境重建，比如角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(limbal niche cells，LNC)的移植時，就更適合采用仍存有部分自體角膜緣干細(xì)胞的部分性LSCD模型。

盡管堿燒傷誘導(dǎo)兔部分性LSCD模型與堿燒傷誘導(dǎo)鼠完全性LSCD模型的成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但前者在2mo的時候已經(jīng)進(jìn)入無充血、角膜上皮結(jié)膜化的炎癥穩(wěn)定階段，而這是接下來用于檢驗LSCD治療方法有效性的理想狀態(tài)。相對于以往報道的3mo制作時間，這種動物模型具有縮短實驗周期，提高研究效率的優(yōu)點。

3.3使用機(jī)械手法還是堿燒傷制作的LSCD動物模型的方法主要有2種，一種是機(jī)械損傷角膜緣[8-11,14-15,17,19-22,25-26,29]；另一種是化學(xué)燒傷，多采用堿，如NaOH[4-5,12-13,20-21,23-24,27]、KOH[16]等，少見的有硫芥子氣[18]。機(jī)械損傷角膜緣的優(yōu)點是可控性較好，可以誘導(dǎo)不同程度的LSCD，包括完全性LSCD和部分性LSCD[30]，然而這種模型與臨床病例的吻合度較低，因為臨床上最常見的LSCD發(fā)病原因為各種化學(xué)或熱燒傷。2017年中山眼科中心的一項研究對堿燒傷和角膜緣機(jī)械切除聯(lián)合角膜上皮刮除這兩種方法制作的完全性兔LSCD模型進(jìn)行了比較。該研究表明這兩種方法均可造模成功，堿燒傷組的角膜混濁、新生血管化較機(jī)械切除組嚴(yán)重，適合用于與新生血管相關(guān)的研究；角膜緣機(jī)械切除聯(lián)合上皮刮除對角膜基質(zhì)的損傷較小，角膜基質(zhì)的微環(huán)境保存良好，更適合于研究干細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞相互作用、微環(huán)境及干細(xì)胞替代療法[21]。機(jī)械手法對術(shù)者技巧要求較高，無疑增加了可重復(fù)性的難度。最重要的是，在臨床中導(dǎo)致LSCD的病因并非機(jī)械損傷，而是化學(xué)燒傷，特別是堿燒傷所導(dǎo)致。所以，采用堿燒傷的方法制作LSCD模型更貼合臨床患者的實際情況。

綜上所述，目前關(guān)于制作LSCD模型的研究中極少提及模型的制作成功率，而這一指標(biāo)對研究者選擇動物模型，提高研究效率有重要意義。本研究的結(jié)果提示堿燒傷誘導(dǎo)LSCD模型是比較可靠的方法(鼠完全性LSCD的成功率及兔部分性LSCD的成功率分別是92%和100%)。盡管兩種方法誘導(dǎo)LSCD模型的成功率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，相對于小鼠完全性LSCD，兔部分性LSCD具有成功率高、易于暴露病變區(qū)域進(jìn)行觀察記錄的優(yōu)點，因此可能具有更高的可重復(fù)性，有利于不同研究者之間的結(jié)果比較和客觀評價，是一種比較好的LSCD研究動物模型。剪除第三眼瞼使這種部分性LSCD兔動物模型更易于被觀察和記錄。