重樓內(nèi)生菌多樣性及其應(yīng)用研究

鹿璐

（西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南昆明 650224）

植物內(nèi)生菌是指生活史中的某一階段生活在植物組織內(nèi)，但對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的真菌，包括那些在其生活史中的某一階段表面生的腐生菌，對(duì)宿主暫時(shí)沒(méi)有傷害的潛伏病原菌和菌根菌[1]。藥用植物內(nèi)生菌的研究始于1993年，Stierle等[2]從短葉紅豆杉的韌皮部分離得到一株名為安德氏紫杉霉（Taxomyces andreanne）能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌。內(nèi)生菌普遍存在于植物各部分組織中，具有豐富的多樣性。部分植物內(nèi)生菌在促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、生物防治及基于生物活性研究的藥物開(kāi)發(fā)等方面具有經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值及生態(tài)效益。

重樓是百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris L.）植物的統(tǒng)稱，藥用的主要是滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.)Hand. Mazz].和華重樓[Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.)Hara]。作為云南白藥、宮血寧等著名中成藥的主要原料，其根莖中含有的皂苷類化合物，具有抗癌、止血、消炎和免疫調(diào)節(jié)等的活性。當(dāng)前，重樓的發(fā)展面臨野生資源消耗過(guò)快，人工種植種苗繁育技術(shù)難度大，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等難題。這些特性使得重樓成為當(dāng)前藥用植物內(nèi)生菌的研究熱點(diǎn)植物之一，重樓內(nèi)生菌的研究對(duì)于其資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用具有非常重要的意義。本文將對(duì)近些年重樓植物內(nèi)生菌的研究作概述。

1 重樓植物內(nèi)生菌的分離、鑒定及多樣性

多年來(lái)，多位研究者采用培養(yǎng)法對(duì)不同地理種源的重樓植物內(nèi)生菌進(jìn)行分離、鑒定，對(duì)其多樣性進(jìn)行了闡釋。段榮婷等[3]從云南彌勒和臨滄兩地野生滇重樓分根、莖、葉3個(gè)部位分離得到42株內(nèi)生真菌。利用形態(tài)學(xué)分析及ITS序列分析進(jìn)行鑒定，分離所得內(nèi)生真菌歸屬于16個(gè)屬，其中彌勒滇重樓歸屬于13個(gè)屬，而臨滄滇重樓歸屬于8個(gè)屬。王茜等[4]通過(guò)對(duì)云南省嵩明縣、鶴慶縣、保山市野生滇重樓植株的根、塊莖、葉中分離，共得到內(nèi)生真菌749株?；贗TS序列分析和形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒定，所得菌株歸屬于41個(gè)屬，其中3個(gè)屬僅在根部出現(xiàn)、12個(gè)屬僅在塊莖出現(xiàn)、8個(gè)屬僅在葉部出現(xiàn)。周先治等[5]分離了華重樓健康植株和莖腐病感病植株根莖、莖、葉等不同部位的細(xì)菌，共獲得65株內(nèi)生細(xì)菌。采用DNA測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行了初步鑒定。健株中的內(nèi)生細(xì)菌分屬4屬11種，以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，根莖部菌量最高，葉部菌量較低。病株的內(nèi)生細(xì)菌分屬10屬14種，以假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌群，莖部菌量最高，葉部較低。不同植株或同個(gè)植株的不同部位內(nèi)生菌多樣性不同。魏娟等[6]從人工栽培云南重樓的根莖中分離純化得到40株內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）分離頻率分別為35%、27.5%，是其優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌群；野生云南重樓的根莖中分離純化得到44株內(nèi)生細(xì)菌，芽孢桿菌屬（Bacillus）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）分離頻率分別為36.4%、20.4%，是其優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌群。廖秋紅等[7]利用栽培于云南大理的滇重樓為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其葉、莖、根狀莖等部位的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離、純化，葉中分離純化得到18株內(nèi)生細(xì)菌，莖中分離純化得到9株內(nèi)生細(xì)菌，根莖中分離純化得到22株內(nèi)生細(xì)菌，共49株內(nèi)生細(xì)菌。通過(guò)16S RNA測(cè)序方法對(duì)其種類進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示滇重樓葉中內(nèi)生細(xì)菌含有8屬11種，莖中含有2屬5種，根莖中含有9屬11種。此外，還有多人對(duì)重樓內(nèi)生菌進(jìn)行分離、鑒定，詳細(xì)情況總結(jié)于表1。

表1 重樓屬植物內(nèi)生菌分離、鑒定統(tǒng)計(jì)表

2 重樓植物內(nèi)生菌的應(yīng)用

2.1 抑菌活性

重樓植物內(nèi)生菌的抑菌活性研究主要集中于分離所得的菌對(duì)常見(jiàn)作物致病菌、土傳病原菌及人類病原菌等的抑制作用。施蕊等[10]從滇重樓塊莖中分離得到98株內(nèi)生真菌。采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法和發(fā)酵液萃取物制平板的方法篩選出部分對(duì)土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有抑制作用的菌株。孫靜賢等[12]對(duì)10株分離自滇重樓的內(nèi)生真菌的發(fā)酵物乙醇提取物進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，采用濾紙法以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌為指示菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。其中菌株YL0401發(fā)酵物乙醇提取物具有較高的抗菌活性，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS-rDNA序列分析鑒定菌株YL0401為墻粘鞭霉（Gliomastix murorum）。宣群等[13]分別于春冬季從滇重樓植株不同部位分離得到內(nèi)生真菌19株。在體外，用指示菌株金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)菌、普通變形桿菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌及白色念珠菌進(jìn)行抑菌活性篩選，最終得到一株編號(hào)為的LRF4內(nèi)生真菌菌株對(duì)白色念珠菌有較強(qiáng)抑制作用，形態(tài)鑒定為無(wú)孢菌群。楊正強(qiáng)等[14]從華重樓的地下塊莖中分離到一株內(nèi)生細(xì)菌（SS02），試驗(yàn)表明其發(fā)酵液對(duì)綠色木霉（Trichoderma viride）、蘆筍莖枯病菌（Phoma asparagi Sacc）、番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、楊樹(shù)潰瘍病菌（Dothiorella gregaria）等13種作物致病菌的生長(zhǎng)有抑制作用。形態(tài)和生理生化特征表明，SS02屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌。雍彬等[19]從華重樓塊莖中分離純化得到一株具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌Iun35，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將分離得到的Iun35菌株發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液上清經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析和DEAE-32纖維素柱層析分離純化出一種抗菌蛋白UD35。用該蛋白對(duì)多種植物病原菌進(jìn)行拮抗測(cè)定，結(jié)果顯示，Iun35對(duì)玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha）等多種菌有強(qiáng)烈抑制作用。程媛媛等[20]利用前期從華重樓根狀莖中分離出的一株具有較強(qiáng)抗菌活性的細(xì)菌PCE45。對(duì)該菌產(chǎn)生的抗菌肽PCP-1進(jìn)行了分離純化，采用平板對(duì)峙法研究抗菌肽對(duì)真菌菌絲和孢子的影響。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所獲得的抗菌PCP-1熱穩(wěn)定性好，且對(duì)蛋白酶K和胰蛋白酶都有較好的耐受性?？咕腜CP-1抑菌譜廣、活性強(qiáng)，對(duì)許多危害嚴(yán)重絲狀真菌、細(xì)菌都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性。

2.2 促生作用

內(nèi)生真菌可以從宿主植物中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給自身生長(zhǎng)發(fā)育的需要，可以提高抗性，并在宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖中起重要的作用。周濃等[21]發(fā)現(xiàn)接種AM真菌能促進(jìn)滇重樓幼苗的存活率，且不同AM真菌菌株會(huì)影響滇重樓內(nèi)源激素量。楊玲玲等[22]采用的分離、篩選固氮菌的阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果得到25株陽(yáng)性菌株。宋發(fā)軍等[15]利用中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院存有的60株重樓內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的水相提取液和有機(jī)相提取液對(duì)冬小麥種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)8株細(xì)菌的有機(jī)相提取物具有較明顯的促萌發(fā)作用。其中腸桿菌屬74#菌的石油醚相提取物、不動(dòng)桿菌屬108#菌的氯仿相提取物、芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏桿菌屬149#菌的乙酸乙酯相提取物具有較強(qiáng)的促萌作用。而內(nèi)生菌發(fā)酵液的水相提取物均不能促進(jìn)冬小麥種子的萌發(fā)，甚至存在一定的抑制作用。

2.3 生物活性

從植物體中分離的內(nèi)生菌通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測(cè)內(nèi)生真菌體甾化合物的含量和產(chǎn)量，可為深入研究?jī)?nèi)生真菌甾體化合物的代謝規(guī)律奠定基礎(chǔ)。趙明等[8]從華重樓根莖中分離了107株菌，并通過(guò)TLC檢測(cè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物篩選得到了2株可產(chǎn)甾體皂甙的內(nèi)生菌。任智等[9]從華重樓根莖中分離了107株菌，并通過(guò)TLC檢測(cè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物篩選得到了2株可產(chǎn)薯蕷皂甙的內(nèi)生菌；16S rDNA 序列分析將其鑒定為Exiguobacterium acetylicum，與 Bacillus subtilis RZ07。歐亞娟等[16]以七葉一枝花為材料，利用HPLC檢測(cè)對(duì)七葉一枝花內(nèi)生真菌產(chǎn)生的薯芋皂甙元的含量進(jìn)行了比較，篩選出9株屬于4屬的七葉一枝花塊莖內(nèi)生真菌。張曉潔等[11]從產(chǎn)自四川彭州的華重樓地下塊莖中分離得到16株菌。經(jīng)TLC檢測(cè)篩選得到一株編號(hào)為SNUS-1（AY842149）的菌株能分泌重樓皂甙或其類似化合物。16S rDNA測(cè)序結(jié)合該菌株的形態(tài)及生理特征確定將其為托氏假單孢菌（Pseudomonas tolassii）。之后張曉潔等[23]又從野生滇重樓中分離得到16株菌。發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液分別經(jīng)泡沫反應(yīng)、Salkowski反應(yīng)、Liberman反應(yīng)及以薯蕷皂甙元為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的薄層層析分析，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為SNUF-1的真菌和編號(hào)為SNUA-1、SNUA-2的放線菌菌株能分泌甾體皂甙或其類似化合物。曹曉冬等人[24]從滇重樓根狀莖中分離到133株內(nèi)生真菌。對(duì)其中的7株真菌進(jìn)行了生物學(xué)性狀觀察但并未對(duì)其進(jìn)行具體的鑒定，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)定了發(fā)酵液中甾化化合物的產(chǎn)率。

2.4 生物轉(zhuǎn)化

李忠孝等[18]結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS-rDNA序列分析確定菌株YNCA1219的分類學(xué)地位，菌株YNCA 1219鑒定為稻惡苗霉（Fusorium moniliforme Sheld.）。由HPLC圖可以看出，菌株對(duì)孕酮的轉(zhuǎn)化比較完全，得到2個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：11α-羥基孕酮和11α,15β-二氫基孕酮，可進(jìn)一步做的工作。

3 問(wèn)題與展望

內(nèi)生真菌普遍存在于目前已研究過(guò)的各種藥用植物中。從目前已經(jīng)研究過(guò)的藥用植物來(lái)看，未發(fā)現(xiàn)沒(méi)有分離到內(nèi)生真菌的，可以推斷內(nèi)生真菌在藥用植物體內(nèi)普遍存在[25]。藥用植物中，青霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、木霉屬、交鏈抱屬等的出現(xiàn)頻率較高[26]，根據(jù)統(tǒng)計(jì)在重樓植物中這些屬的內(nèi)生菌出現(xiàn)頻率也較高。但總體來(lái)說(shuō)不同樣地、不同部位的重樓材料所分離得到的內(nèi)生菌仍具有較大差異性，這樣豐富的多樣性可能與樣地生境以及各部位結(jié)構(gòu)、成分等多種因素有關(guān)。

雖然對(duì)重樓植物內(nèi)生菌的多樣性及應(yīng)用等方面已經(jīng)有了一定研究，但關(guān)于內(nèi)生菌與重樓之間的共生機(jī)制與內(nèi)生菌可產(chǎn)皂苷等宿主植物相似代謝產(chǎn)物的原理仍然有待研究。幾乎所有的植物都存在內(nèi)生菌，它們與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，一同構(gòu)成穩(wěn)定的關(guān)系。一些理論認(rèn)為宿主植物與內(nèi)生菌的共生體內(nèi)，一旦次生代謝中有用生化途徑出現(xiàn)，該途徑就能被其他生物利用，表現(xiàn)出相互作用和協(xié)同進(jìn)化。內(nèi)生菌在與宿主植物長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中也可能通過(guò)遺傳信息的傳遞獲得宿主植物的特定代謝途徑，從而使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[27]。從次生代謝的角度探討重樓與內(nèi)生菌之間的相互作用和協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，或可更好地了解其共生機(jī)制及內(nèi)生菌可產(chǎn)重樓植物相似代謝產(chǎn)物的原理，解決重樓植物內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物含量由于分離純化及頻繁傳代導(dǎo)致的含量不穩(wěn)定等問(wèn)題[28]。

從研究方法上來(lái)說(shuō)，重樓植物內(nèi)生菌的研究多數(shù)是先利用培養(yǎng)法來(lái)分離鑒定內(nèi)生菌，但即使使用多種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，仍無(wú)法將所有生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌全部被分離出來(lái)，有的內(nèi)生菌不能離開(kāi)宿主植物在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，有的存在量極小難于分離，有的在嚴(yán)格的表面消毒過(guò)程被誤殺。在其他一些植物上，也有使用免培養(yǎng)法對(duì)植物內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行研究，然而一些研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)法分離鑒定得到的有些菌種在免培養(yǎng)法鑒定中并未獲得。因此，為更加全面地對(duì)滇重樓屬植物內(nèi)生菌多樣性展開(kāi)研究，未來(lái)應(yīng)充分結(jié)合兩種分析方法進(jìn)行使用。

總體來(lái)說(shuō)，重樓植物內(nèi)生菌的研究已有了不少研究成果，但目前內(nèi)生菌在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起步階段，研究多限于內(nèi)生菌對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育、有效成分等的研究，對(duì)其具體作用機(jī)制仍不明確，其實(shí)際應(yīng)用效果也還有待研究和實(shí)踐，未來(lái)還有更多研究需要去做。