西瓜炭疽病接種技術(shù)規(guī)程

魏春華 郜森 甘露 羅婷 張勇 李好 馬建祥 楊建強(qiáng) 張顯

摘 要： 西瓜是我國(guó)重要的葫蘆科經(jīng)濟(jì)作物。炭疽病作為一種在西瓜整個(gè)生長(zhǎng)期廣發(fā)的真菌性病害，已嚴(yán)重影響了我國(guó)西瓜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展?，F(xiàn)根據(jù)西瓜炭疽病的生物學(xué)特性，結(jié)合已有的研究成果，對(duì)西瓜炭疽病的危害癥狀、病原菌形態(tài)學(xué)特征、西瓜炭疽病病菌的分離及培養(yǎng)、人工接種鑒定技術(shù)等作了描述和規(guī)定，并制定了西瓜炭疽病接種技術(shù)規(guī)程。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 炭疽?。?人工接種； 鑒定標(biāo)準(zhǔn)； 技術(shù)規(guī)程

西瓜是葫蘆科重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界第五大水果。我國(guó)是最大的西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)。據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料顯示，2016年我國(guó)西瓜的種植面積為189.08萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量高達(dá)7 940萬(wàn)t。因此，西瓜在我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收中發(fā)揮著重要的作用[1]。

炭疽病作為一種真菌性病害，在西瓜的整個(gè)生長(zhǎng)期都可發(fā)生，其對(duì)西瓜的危害僅次于枯萎病。西瓜炭疽病由瓜類炭疽病菌[Colletorichum lagenerium （Pass.） Ell.et Halst]引起，屬半知菌亞門，黑盤孢目，刺盤孢屬真菌。目前，已知的瓜類炭疽病菌有7個(gè)生理小種，其中生理小種1和3對(duì)西瓜的危害最大[2]。不同的生理小種可通過(guò)特定的鑒別寄主進(jìn)行鑒定。潮濕環(huán)境可引起該病的大規(guī)模爆發(fā)，造成西瓜減產(chǎn)，甚至絕收[3]。因此，種植戶在防治過(guò)程中，往往會(huì)濫用化學(xué)農(nóng)藥，不僅造成投入成本的增加，同時(shí)也在一定程度上影響了西瓜的品質(zhì)，甚至對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞。而抗性品種的選育將在根源上解決這一生產(chǎn)難題?；诖?，筆者根據(jù)西瓜炭疽病的生物學(xué)特征及病害癥狀，結(jié)合已有的研究基礎(chǔ)制定了西瓜炭疽病的人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程，該規(guī)程經(jīng)多次應(yīng)用驗(yàn)證，適合于西瓜炭疽病的鑒定，為抗病種質(zhì)的篩選提供可靠的參考依據(jù)。

1 西瓜炭疽病病害癥狀

葉片染病初期為黃色水漬狀圓形小斑，后小斑逐漸擴(kuò)展并附有同心輪紋，病斑直徑0.5～1.5 cm，易穿孔，呈褐色且外緣常伴有黃色暈圈（圖1）。通常病斑顏色較為均勻，上面有散生黑色小點(diǎn)，當(dāng)環(huán)境濕度增大時(shí)，會(huì)出現(xiàn)粉紅色黏稠狀膠狀物。后期病葉由于病斑易干枯破碎而早衰。若葉柄或蔓上染病，初期呈現(xiàn)水浸狀黃褐色的梭形或長(zhǎng)橢圓凹陷病斑，后病斑逐漸擴(kuò)大并轉(zhuǎn)變黑褐色，最后引起莖蔓逐漸死亡。若果柄染病，初期幼果顏色深暗，后逐漸萎縮致死。若果實(shí)染病，初期為暗綠色油漬狀小斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成表面凹陷并附有輪紋的圓形暗褐色病斑，通常隨著病斑的生長(zhǎng)，在中央會(huì)出現(xiàn)龜裂（圖1）。當(dāng)空氣濕度大時(shí)，病斑上出現(xiàn)黑色小顆粒，并有粉紅色黏稠的分生孢子團(tuán)，嚴(yán)重時(shí)，病斑連片，西瓜腐爛，失去商品性，從而造成西瓜減產(chǎn)[4]。在西瓜的貯放或運(yùn)輸過(guò)程中，炭疽病也時(shí)常發(fā)生，從而造成西瓜腐爛、變質(zhì)失去商品價(jià)值，造成損失。

2 西瓜炭疽病病原菌形態(tài)學(xué)特征

西瓜炭疽病通常由瓜類炭疽病生理小種1或3引起。瓜類炭疽病菌分生孢子盤生有黑褐色剛毛，長(zhǎng)90～120 ?m，具有2～5個(gè)隔膜，初期埋于寄主表皮下，成熟后突破表皮外露（圖2）。其分生孢子梗無(wú)色，單孢呈圓筒狀，大小為（20～ 26） ?m×（2.6～3.0） ?m。分生孢子無(wú)色，單孢為卵圓或長(zhǎng)圓形，具有2～3個(gè)橫膈膜，大小為（14～20） ?m×（5～6） ?m，多個(gè)孢子聚合一起形成粉紅色黏孢子團(tuán)。

隨著炭疽病菌在培養(yǎng)基上不斷生長(zhǎng)，菌落逐漸形成。培養(yǎng)2～3 d后，菌落為乳白色且有絨毛狀的氣生菌絲；3～5 d后，菌落在增大的同時(shí)變?yōu)榉奂t色，顏色從中心到邊緣漸淺；5～7 d后，菌落顏色由中心至邊緣變?yōu)樯罨疑?，邊緣波狀，出現(xiàn)同心輪紋；7～12 d后，菌落變?yōu)樯罨疑?，且邊緣有一圈淡粉色暈圈；在培養(yǎng)12～15 d后，菌落出現(xiàn)紅褐色黏稠狀孢子團(tuán)。

3 西瓜炭疽病的分離及培養(yǎng)

抗病材料的篩選無(wú)疑會(huì)為西瓜抗炭疽病品種的選育提供重要的材料資源。不同西瓜材料對(duì)炭疽病抗性的鑒定可分為自然條件下的抗性鑒定和人工接種抗性鑒定，前者受環(huán)境因素的影響較大，且周期長(zhǎng)、不定因素較多，不易控制；而后者可顯著地縮短鑒定周期，且可減少環(huán)境因素的影響，故可相對(duì)準(zhǔn)確地鑒定出不同材料對(duì)炭疽病的抗性。但瓜類炭疽病菌在普通的培養(yǎng)基上只長(zhǎng)菌絲而少產(chǎn)孢子。因此，如何在短期內(nèi)獲得足夠的炭疽病孢子就成為了人工接種鑒定材料抗病性的關(guān)鍵步驟[6]。

3.1 病原菌分離

從田間采集病葉（或其他感病組織），先經(jīng)過(guò)0.1% HgCl2消毒2 min，再用滅菌的蒸餾水沖洗3～4次后，放置在已經(jīng)過(guò)高溫滅菌的鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，保濕2～3 d后，挑取少量產(chǎn)生的孢子于無(wú)菌水中制成孢子懸浮液。用接種環(huán)接種少量孢子懸浮液于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病原菌在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，長(zhǎng)成為直徑約1 cm的菌落后，目鏡檢測(cè)，并挑取邊緣少量菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行二次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。如此經(jīng)過(guò)3～4次轉(zhuǎn)接后，可使菌種得到純化。每次轉(zhuǎn)接前，需對(duì)菌落形態(tài)和顏色進(jìn)行觀察，同時(shí)鏡檢，確認(rèn)為西瓜炭疽病菌。

3.2 病原菌回接鑒定

在抗性鑒定之前，為確保分離得到的是西瓜炭疽病病原菌，將分離純化的病原菌配成1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。采用噴霧法將孢子懸浮液接種于感病材料‘玲瓏王的西瓜幼苗上，20株為1組，重復(fù)3次。將接種后的西瓜幼苗置于24～26 ℃、相對(duì)濕度（RH）為95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后，再置于正常的生長(zhǎng)環(huán)境中，觀察發(fā)病情況。

3.3 病原菌孢子繁殖

為獲得用于抗病性鑒定的大量孢子懸浮液，將上述經(jīng)過(guò)回接驗(yàn)證的孢子用無(wú)菌蒸餾水懸浮后（或直接挑取少量菌絲），接種于培養(yǎng)基上置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)表明，接種于西瓜皮培養(yǎng)基上再培養(yǎng)10 d左右，即可獲得粉紅色孢子團(tuán)；而在PDA培養(yǎng)基需要培養(yǎng)12～15 d才可產(chǎn)孢子。因此在有果實(shí)的季節(jié)，推薦使用西瓜果皮培養(yǎng)基；其他時(shí)候推薦PDA培養(yǎng)基。

西瓜果皮培養(yǎng)基配方：200 g西瓜果皮煮汁+15 g瓊脂，定容至1 L；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯200 g，加水1 L，煮沸30 min，紗布過(guò)濾后+20 g葡萄糖+ 15 g瓊脂，定容至1 L。

4 西瓜炭疽病人工接種

將擴(kuò)繁的孢子團(tuán)用無(wú)菌蒸餾水稀釋至1×106個(gè)·mL-1，以無(wú)菌水為對(duì)照。采用噴霧法接種于待鑒定的不同西瓜種質(zhì)幼苗（2葉1心時(shí)期），以15～25株幼苗為1組，重復(fù)3次，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)法。接種后的幼苗置于24～26 ℃、相對(duì)濕度（RH）為95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后，置于正常生長(zhǎng)條件下。接種3 d后，觀察感病情況。根據(jù)劉莉等[7]研究，計(jì)算病情指數(shù)（DI）。

離體葉人工接種方法同樣能夠真實(shí)地鑒定西瓜種質(zhì)的抗病性[8]。選取葉齡為15～20 d的真葉（剪口用石蠟固封），同樣將孢子團(tuán)用無(wú)菌蒸餾水稀釋至1×106個(gè)·mL-1，以無(wú)菌水為對(duì)照，采用微量注射器進(jìn)行懸滴法接種（30滴左右）。將接種后的葉片放置于4層飽和吸水（無(wú)菌水）的濾紙上，并用塑料薄膜覆蓋保濕（相對(duì)濕度100%）后，置于滅菌后的培養(yǎng)皿中。在24～26 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗處理24 h后，置于正常生長(zhǎng)條件下，6 d后觀察發(fā)病情況。采用平均病斑直徑法（Average Diameter of Lesion，簡(jiǎn)稱AD）進(jìn)行發(fā)病統(tǒng)計(jì)[8]。

5 西瓜炭疽病的鑒定標(biāo)準(zhǔn)

參考劉莉等研究[7]，根據(jù)葉片病斑數(shù)目及植株整體生長(zhǎng)情況，將西瓜幼苗對(duì)炭疽病的抗性分為6個(gè)等級(jí)：0、1、3、5、7、9。0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：輕微侵染，僅子葉上有少數(shù)小病斑（1～5個(gè)）；3級(jí)：中度侵染，真葉發(fā)病，少數(shù)病斑（6～10個(gè)）；5級(jí)：嚴(yán)重侵染，病斑較多（11～20個(gè)）；7級(jí)：侵染非常嚴(yán)重，壞死斑擴(kuò)大；9級(jí)：發(fā)病嚴(yán)重，植株死亡。病情指數(shù)（DI）計(jì)算公式如下：

DI=[各病情指數(shù)×該病情代表數(shù)最高病級(jí)代表數(shù)×調(diào)查總株數(shù)][×]100

其抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0為免疫；11%以下為高抗；12%～33%為抗?。?4%～55%為輕度抗?。?6%～77%為感?。?8%以上為高感。

鑒于上述鑒定方法在等級(jí)劃分時(shí)，存在人為主觀造成的試驗(yàn)誤差且數(shù)據(jù)計(jì)算復(fù)雜，故建議采用平均病斑直徑法（AD）進(jìn)行發(fā)病統(tǒng)計(jì)[8]。病情指數(shù)（AD）計(jì)算公式如下：

AD=[發(fā)病病斑直徑/mm接種總滴數(shù)]

其中分子為各病斑直徑的總和，而分母為接種總滴數(shù)，包括發(fā)病接種滴數(shù)和未發(fā)病接種滴數(shù)。根據(jù)AD值，按以下抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)材料炭疽病抗性進(jìn)行劃分：0.0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗??；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感??；>3.01 mm，高感。

本技術(shù)規(guī)程對(duì)西瓜炭疽病的形態(tài)學(xué)特征和病害癥狀進(jìn)行了詳細(xì)描述，同時(shí)對(duì)病原菌的擴(kuò)繁、接種方法及抗病鑒定指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)性規(guī)范。該技術(shù)規(guī)程的制定，將為炭疽病抗性種質(zhì)資源的篩選提供技術(shù)指導(dǎo)，進(jìn)而為抗性新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 農(nóng)業(yè)部. 2016年全國(guó)各地蔬菜、西瓜、甜瓜、草莓、馬鈴薯播種面積和產(chǎn)量[J]. 中國(guó)蔬菜，2018（1）： 18.

[2] 崔麗紅，黃蔚，成娟. 西瓜抗炭疽病遺傳育種的研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）： 172-174.

[3] 梅麗艷，王喜慶，賈云鶴，等. 西瓜炭疽病癥狀觀測(cè)及發(fā)生危害調(diào)查[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（12）： 55-58.

[4] 韓華，崔志紅. 西瓜常見病害及其綜合防治技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14（3）： 141-141.

[5] 羅婷. 西瓜苗期炭疽病抗性鑒定方法及其抗病機(jī)理研究[D]. 陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[6] 劉志恒，唐爽爽，楊璐，等. 西瓜炭疽病菌圓刺盤孢分生孢子產(chǎn)生條件的研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2015（1）： 75-81.

[7] 劉莉，王鳴. 西瓜種質(zhì)資源苗期對(duì)炭疽病抗性的研究[J]. 中國(guó)西瓜甜瓜，1990，3（1）： 9-13.

[8] 文生倉(cāng)，王鳴. 西瓜炭疽病人工接種鑒定的新方法──離體葉接種和AD評(píng)價(jià)法[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，22（1）： 17-22.