金納米粒子比色法檢測(cè)卡那霉素的研究

張彩艷， 馮榮榮， 李曉霞

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安 716000)

卡那霉素(Kanamycin，KM) 是一種氨基糖苷類抗生素，因其價(jià)格低廉、抗菌性強(qiáng)，被廣泛用做獸藥。但若食用過量KM殘留的動(dòng)物源性食品會(huì)導(dǎo)致耳毒性、腎毒性等副作用[1-3]。因此，建立快速、靈敏、低成本檢測(cè)食品中KM殘留的方法具有重要意義。目前報(bào)道KM的主要測(cè)定方法有色譜法[4-5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、電化學(xué)法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]等。但這些方法存在儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)耗時(shí)，樣品的預(yù)處理步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

金納米粒子(AuNPs)比色法是基于AuNPs表面等離子共振效應(yīng)的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。與其他方法相比，可將分子識(shí)別轉(zhuǎn)換為顏色變化，通過肉眼進(jìn)行判斷，進(jìn)而通過儀器進(jìn)一步定量分析測(cè)定。方法因原理簡單、無需大型儀器、操作成本低且便于直接觀測(cè)，被廣泛用來檢測(cè)DNA、金屬離子、蛋白質(zhì)、陰離子和小分子等物質(zhì)[10]。本文基于AuNPs比色法構(gòu)建了兩種檢測(cè)KM的新方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接加入KM可使AuNPs顏色發(fā)生變化，且紫外吸收波長紅移，吸光度降低。而采用核酸適配體AuNPs比色法測(cè)定，由于核酸適配體與KM結(jié)合，釋放出單鏈DNA吸附于AuNPs表面使其保持穩(wěn)定，顏色不發(fā)生變化。結(jié)果表明，方法一操作簡單，但選擇性較差。方法二檢測(cè)KM的線性范圍、檢出限和選擇性較方法一更好。兩種方法均可用于牛奶樣品中KM的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

8453型紫外可見分光光度計(jì)(美國,安捷倫公司)；LG10-2.4A高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純有限公司)。

卡那霉素適配體：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA GTC AC-3′，部分互補(bǔ)DNA：5′-TAT GTG ACT CGG CTT-3′，硫酸卡那霉素(Kanamycin,KM)，硫酸慶大霉素(Gentamycin,GM)，鹽酸四環(huán)素(Tetracycline,TC)，硫酸新霉素(Neomycin,NM)和硫酸鏈霉素(Streptomycin,SM)，均購自上海生工生物工程股份有限公司。DNA序列在使用前要用超速離心機(jī)離心5 min，加水配成一定濃度的溶液， 4°C冰箱中保存待用。HAuCl4·4H2O購自國藥集團(tuán)。所用其它試劑均為分析純。

伊利純牛奶購自本地超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

AuNPs參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[11]合成。

AuNPs比色法：將1 mL AuNPs與140 μL不同濃度KM溶液在室溫下反應(yīng)70 min，觀察顏色變化并用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定 520 nm和 620 nm處的吸光度值。

核酸適配體AuNPs比色法：在50 μL 4 μmol/L部分互補(bǔ)單鏈DNA中，加入60 μL 4 μmol/L KM適配體，再加入90 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)，室溫下反應(yīng)60 min。獲得1 μmol/L dsDNA溶液。將10 μL 1 μmol/L dsDNA與 10 μL未知濃度KM溶液，在室溫下反應(yīng)40 min后，加入100 μL AuNPs在室溫下再反應(yīng)10 min，最后加入5 μL 0.5 mol/L NaCl溶液，靜置12 min。測(cè)定520 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs比色法測(cè)定卡那霉素

2.1.1實(shí)驗(yàn)原理圖1A為AuNPs比色法檢測(cè)KM的原理圖，在酒紅色的AuNPs中加入不同濃度的KM，AuNPs顏色由酒紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。原因是在含檸檬酸鹽的AuNPs溶液中，檸檬酸根陰離子會(huì)組裝于帶正電荷的AuNPs表面，使AuNPs成為帶負(fù)電荷的超分子化合物。未加KM，分散狀態(tài)下AuNPs呈酒紅色，粒徑約為13 nm。加入KM，荷負(fù)電AuNPs與質(zhì)子化的KM陽離子因靜電引力和疏水作用力結(jié)合，形成粒徑更大的聚集體，平均粒徑從13 nm 增至20 nm，使AuNPs溶液顏色由酒紅色變?yōu)樽仙蛘咚{(lán)色。實(shí)驗(yàn)對(duì)加入KM前后AuNPs溶液的吸收光譜進(jìn)行了掃描，結(jié)果如圖1B所示， AuNPs的最大吸收波長為520 nm(曲線a)，根據(jù)吸光度計(jì)算得AuNPs的濃度為2.1×10-9mol/L(ε=4.2×108L/(mol·cm))。當(dāng)加入3.0 μmol/L KM后，520 nm處的吸光度明顯降低，620 nm處吸光度增加(曲線b)。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道AuNPs在520 nm 處吸收峰的吸光度會(huì)降低，同時(shí)在620 nm左右產(chǎn)生團(tuán)聚態(tài)AuNPs的共振吸收一致[12]。說明KM與AuNPs發(fā)生作用，可以用AuNPs比色法對(duì)KM進(jìn)行測(cè)定。

圖1 AuNPs比色法檢測(cè)KM原理圖(A)及紫外-可見吸收光譜圖(B)Fig.1 Schematic diagram showing colorimetric detection of kanamycin using AuNPs (A) and absorption spectra of AuNPs and in presence of kanamycin (B)(a)AuNPs(cAuNPs=2.1×10-9 mol/L);(b)AuNPs+KM (cAuNPs=2.1×10-9 mol/L,cKM=3.0 μmol/L).

2.1.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化分別考察了AuNPs與KM溶液的反應(yīng)時(shí)間和KM溶液的體積對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AuNPs與KM溶液的反應(yīng)時(shí)間到60 min 后，吸光度比值A(chǔ)620/A520基本恒定，故本實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為70 min。當(dāng)加入KM體積為120 μL時(shí)，A620/A520吸光度比值基本恒定。因此，KM溶液的體積為140 μL。

圖2 加入不同濃度KM后AuNPs-KM溶液的紫外-可見(UV-Vis)光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 UV-Vis spectra of AuNPs-KM after reaction with different concentrations of KM(Inset is the standard curve)a→f:0,0.1,1.0,2.0,3.0,4.0 μmol/L,respectivity.

2.1.3分析特性在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定了不同濃度KM與AuNPs作用的吸光度值。由圖2可知，AuNPs的吸光度比值A(chǔ)620/A520與KM的濃度在0.1 ～ 4.0 μmol/L范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，其線性方程為：A620/A520=0.1157c(μmol/L)+0.1699 (r=0.9935)，檢出限(S/N=3)為33 nmol/L。

2.1.4實(shí)際樣品分析牛奶樣品處理參照文獻(xiàn)方法[8]。將KM加入到處理好的牛奶樣品中，分別配制成含0.5、1.0、2.0 μmol/L KM的加標(biāo)樣品，然后按照1.2節(jié)方法測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果如表1。

2.1.5選擇性實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了多種不同抗生素對(duì)檢測(cè)KM的影響。分別在AuNPs-3 μmol/L KM溶液里加入慶大霉素(GM)，新霉素(NM)，鏈霉素(SM)和四環(huán)素(TC)。結(jié)果如圖3所示，同倍的慶大霉素和新霉素，10倍的鏈霉素和100倍的四環(huán)素對(duì)測(cè)定有干擾。

2.2 核酸適配體AuNPs測(cè)定KM

2.2.1實(shí)驗(yàn)原理為了提高測(cè)定方法的選擇性和靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用核酸適配體AuNPs比色法對(duì)KM進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理如圖4所示，當(dāng)不含KM時(shí)，核酸適配體與互補(bǔ)鏈DNA形成穩(wěn)定的雙鏈，高濃度NaCl溶液導(dǎo)致AuNPs團(tuán)聚，顏色從酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。在雙鏈DNA中加入KM，由于適配體與KM結(jié)合，釋放出部分互補(bǔ)的單鏈DNA，單鏈DNA可以通過靜電作用吸附到AuNPs表面，保護(hù)AuNPs免于高鹽濃度引起的團(tuán)聚，AuNPs的顏色未發(fā)生變化。

表1 樣品及回收率測(cè)定(n=3)

圖3 AuNPs比色法檢測(cè)KM選擇性圖Fig.3 Selectivity of colorimetric detection of KM based on AuNPsa.AuNPs+3 μmol/L KM；b.a+3 μmol/L GM； c.a+3 μmol/L NM； d.a+30 μmol/L SM； e.a+300 μmol/L TC

圖4 適配體金納米粒子比色法測(cè)定卡那霉素原理示意圖Fig.4 Schematic description of AuNPs based on colorimetric aptamer for kanamycin detection

2.2.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系吸光度的影響。取10 μL 1 μmol/L 雙鏈DNA，加入10 μL 0.01 μmol/L KM，室溫孵育40 min后加100 μL AuNPs，再室溫孵育10 min后加0.5 mol/L NaCl，每2 min測(cè)一次紫外吸收光譜。結(jié)果表明，反應(yīng) 10 min后吸光度比值基本恒定，因此，實(shí)選擇反應(yīng)為12 min。

2.2.3分析特性在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，圖5為加入不同濃度KM后AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果表明，吸光度比值((A0-A)/A)與KM在0.02～0.3 μmol/L濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，線性方程為:(A0-A)/A=0.8642c(μmol/L)+0.3505(r=0.9944)，檢出限(S/N=3)為8 nmol/L。

2.2.4實(shí)際樣品分析實(shí)際樣品牛奶的處理參照文獻(xiàn)方法[8]。將KM加入到處理好的牛奶樣品中，分別配制成含0.03、0.05、0.15 μmol/L KM的加標(biāo)樣品，然后按照1.2方法測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果如表2。

表2 樣品及回收率測(cè)定(n=3)

2.2.5選擇性分別考察了鏈霉素，新霉素，慶大霉素，四環(huán)素對(duì)適配體AuNPs對(duì)KM測(cè)定的影響。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示，加入同倍的新霉素(0.1 μmol/L)和慶大霉素，10倍鍵霉素、100倍的四環(huán)素，顏色無明顯變化，說明其他抗生素對(duì)測(cè)定沒有干擾。分析可能是由于KM與適配體具有高度特異性，故其他抗生素對(duì)卡那霉素適配體的測(cè)定基本沒有影響。

圖5 加入不同濃度KM后AuNPs-DNA-KM溶液的紫外-可見(UV-Vis)光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 UV-Vis spectra of AuNPs-DNA-KM after reaction with different concentrations of KM(Inset is the standard curve)cKM:a-d:0.02,0.04,0.1,0.3(μmol/L).

圖6 適配體金納米比色法檢測(cè)卡那霉素選擇性圖Fig.6 Selectivity of aptamer AuNPs coloorimetric detection of KMa.dsDNA+0.1 μmol/L KM+AuNPs+0.5 mol/L NaCl;b.a+0.1 μmol/L GM;c.a+0.1 μmol/L NM;d.a+10.0 μmol/L SM;e.a+100.0 μmol/L TC.

3 結(jié)論

利用AuNPs比色法構(gòu)建了兩種簡單、靈敏、快速測(cè)定KM的新方法。方法一操作簡單，但選擇性較差。方法二由于采用了核酸適配體，檢測(cè)KM的線性范圍、檢出限和選擇性較方法一更好。這兩種方法可望用于其他抗生素和藥物的快速檢測(cè)。