黔產(chǎn)朱砂蓮多酚含量及其抗氧化活性研究

茍?bào)w忠,劉玉林

(凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

朱砂蓮為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物朱砂蓮(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)的塊根。分布于貴州、四川、湖北、廣西、云南等地[1]。朱砂蓮主要的化學(xué)成分為馬兜鈴酸、生物堿、朱砂蓮素和朱砂蓮苷[1]，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[2]，黔東南州苗族和侗族主要用于治療喉痛、胃痛、肺癆、痢疾、蛇傷等。

多酚類物質(zhì)是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，主要有酚酸、黃酮類、木脂素類和單寧[3]。天然源的多酚具有多種生物活性，如抗癌[4]、阿爾茲海默癥[5]、抗氧化[6]、清除自由基[6]等。植物多酚類物質(zhì)的抗氧化活性一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，然而，朱砂蓮多酚類物質(zhì)的抗氧化活性研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文以朱砂蓮為研究對(duì)象，考察朱砂蓮中酚類物質(zhì)的還原能力和1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)清除率，以便為朱砂蓮酚類物質(zhì)的利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朱砂蓮(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)采自貴州省凱里市雷山縣。特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、福林酚試劑、1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：250249-75-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：5995-86-8，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2550，日本島津公司)；超聲波清洗機(jī)(WH-300，濟(jì)寧萬(wàn)和超聲電子設(shè)備有限公司)；離心機(jī)(TD5M，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 朱砂蓮酚類物質(zhì)的提取

稱取2g朱砂蓮粉末樣品于50 mL離心管中，加入40 mL 70%的乙醇溶液，超聲提取30 min，離心，上層清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用上述步驟將濾渣再處理1次，并用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，待測(cè)。

1.3.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用Folin﹠ciocalteu's 比色法[7]測(cè)定，準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸粉末125 mg于1000 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，得0.125mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別吸取1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于5個(gè)25 mL比色管中，依次加入福林酚試劑1.0 mL、10% Na2CO3溶液6.0 mL，并用超純水定溶至刻度，搖勻，置于暗室中2 h，并在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。以沒(méi)食子酸濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：A=115.62C+0.025，r=0.9999。

1.3.3 朱砂蓮總多酚的測(cè)定

取朱砂蓮提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.2步驟測(cè)定其吸光度，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算提取液總多酚的濃度，再由如下公式計(jì)算朱砂蓮總多酚的含量。

朱砂蓮總多酚含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1

式中：C為反應(yīng)體系溶液的總多酚濃度(mg·mL-1)；VB為比色管量程(25mL)；VT為提取液總體積(100mL)；VR為反應(yīng)體系中提取液體積(0.2 mL)；W為朱砂蓮質(zhì)量(g)。

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用硝酸鋁比色法測(cè)定[8]，準(zhǔn)確稱取0.26 g蘆丁于1000 mL容量瓶中，并用70%乙醇溶液定容至刻度。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL于5個(gè)25 mL比色管中，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min。加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min。加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，放置15 min，并在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為A=11.88C+0.0042，r=0.9999。

1.3.5 朱砂蓮總黃酮的測(cè)定

取朱砂蓮提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.4步驟測(cè)定其吸光度，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算提取液總黃酮的濃度，再由如下公式計(jì)算朱砂蓮總黃酮的含量。

朱砂蓮總黃酮含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1

式中：C為反應(yīng)體系溶液的總黃酮濃度(mg·mL-1)；VB為比色管量程(25mL)；VT為提取液總體積(100 mL)；VR為反應(yīng)體系中提取液體積(0.2 mL)；W為朱砂蓮質(zhì)量(g)。

1.4 朱砂蓮總多酚抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 還原能力

取0.2 mL不同濃度的提取液，并依次加入 pH值=6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1% 的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，搖勻，置于50 ℃水浴振蕩器中振蕩20 min。然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻，取混液 2.5 mL，再加入超純水2.5 mL和 0.1%的氯化鐵溶液2.5 mL，搖勻，靜置 10 min，在 700 nm處測(cè)定其吸光度(As)，以超純水代替提取液作為空白并測(cè)定其吸光度 A0。則還原能力ΔA=As-A0，ΔA其值越大，提取液的還原能力越強(qiáng)[9]。

1.4.2 DPPH·清除率

在比色管中依次加入2×10-4mol·L-1DPPH·溶液2 mL 和不同濃度的提取液2mL，搖勻并置于暗室中30 min，以無(wú)水乙醇為參比液，在517 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)s，以無(wú)水乙醇溶液代替提取液作為空白并測(cè)定其吸光值A(chǔ)0。根據(jù)下式計(jì)算樣品溶液對(duì)DPPH·的清除率：

1.4.3 半抑制濃度IC50的計(jì)算

采用SPSS17.0計(jì)算IC50，IC50表示清除率為50%所對(duì)應(yīng)的濃度，其值越小，說(shuō)明清除能力越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS17.0、Origin8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 朱砂蓮總多酚的含量

按1.3.2節(jié)測(cè)定朱砂蓮提取液中總多酚含量，其值為(87.47±0.21)mg·g-1。

2.2 朱砂蓮總黃酮的含量

按1.3.3節(jié)測(cè)定朱砂蓮提取液中總黃酮含量，其值為(245.00±0.50)mg·g-1。

2.3 朱砂蓮總多酚抗氧化活性分析

2.3.1 朱砂蓮總多酚對(duì)還原能力的影響

朱砂蓮總多酚(AT)及其對(duì)照組(TBHQ)還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1可知，還原能力隨朱砂蓮總多酚和TBHQ濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，且朱砂蓮總多酚的還原能力明優(yōu)于TBHQ。其次，朱砂蓮總多酚濃度與還原能力之間顯著的正相關(guān)關(guān)系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為酚類物質(zhì)[21]。

圖1 朱砂蓮總多酚對(duì)還原能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.1 Effection of total polyphenol on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.3.2 朱砂蓮總多酚(AT)對(duì)DPPH·清除能力的影響

朱砂蓮總多酚(AT)及其對(duì)照組(TBHQ)DPPH·清除能力見(jiàn)圖2。圖2可知，朱砂蓮總多酚的DPPH·清除能力明顯優(yōu)于TBHQ。同時(shí)，朱砂蓮總多酚濃度與DPPH·清除率之間較高的正相關(guān)關(guān)系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為酚類物質(zhì)[11]。此外，朱砂蓮總多酚的IC50值(0.004 g·L-1)遠(yuǎn)小于TBHQ 的IC50值(0.024 g·L-1)，也小于其他中草藥的IC50值，如：黃芪[12](IC50=0.017 g·L-1)、鐵皮石斛[13](IC50=0.395 g·L-1)、枸杞[14](IC50=0019 g·L-1)、柿葉[15](IC50=0.85 g·L-1)、地榆[16](IC50=0.691 g·L-1)、蛇莓(0.018 g·L-1)[17]、果上葉(0.022 g·L-1)[18]等。分析認(rèn)為，朱砂蓮總多酚具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

圖2 朱砂蓮總多酚對(duì)DPPH·清除能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.2 Effection of total polyphenol on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.4 朱砂蓮總黃酮抗氧化活性分析

2.4.1 朱砂蓮總黃酮對(duì)還原能力的影響

朱砂蓮總黃酮(AT)及其對(duì)照組(TBHQ)還原能力分析結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3可知，還原能力隨朱砂蓮總黃酮和TBHQ濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但朱砂蓮總黃酮的還原能力略低于TBHQ。此外，朱砂蓮總黃酮濃度與還原能力之間較高的正相關(guān)關(guān)系也表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為黃酮類物質(zhì)。

圖3 朱砂蓮總黃酮對(duì)還原能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.3 Effection of total flavonoids on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

2.4.2 朱砂蓮總黃酮對(duì)DPPH·清除能力的影響

朱砂蓮總黃酮(AT)及其對(duì)照組(TBHQ)的DPPH·清除能力見(jiàn)圖4。圖4可知，朱砂蓮總黃酮的DPPH·清除能力略低于TBHQ。此外，朱砂蓮總黃酮濃度與DPPH·清除率之間較高的正相關(guān)關(guān)系，表明在朱砂蓮中的主要抗氧化活性成分為黃酮類物質(zhì)。同時(shí)，朱砂蓮總黃酮的IC50值0.24 g·L-1)略大于TBHQ 的IC50值0.14 g·L-1)，但小于其他中草藥總黃酮的IC50值，如：銀杏葉[9](IC50=3.45 g·L-1)、黃芪[19](IC50=12.01 g·L-1)、藤茶[20](IC50=3.32 g·L-1)、鐵包金[20](IC50=36.41 g·L-1)、貢菊[21](IC50=0.323 g·L-1)等。分析認(rèn)為，朱砂蓮總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

圖4 朱砂蓮總黃酮對(duì)DPPH·清除能力的影響，不同小寫字母表示差異顯著水平(α<0.05)

Fig.4 Effection of total flavonoids on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level

3 結(jié)論

朱砂蓮總多酚和總黃酮的含量均較高，其值分別為(87.47±0.21)mg·g-1和(245.00±0.50)mg·g-1；朱砂蓮總多酚還原能力和DPPH自由基清除率高于TBHQ，但朱砂蓮總黃酮還原能力和DPPH自由基清除率小于TBHQ；朱砂蓮總多酚清除DPPH自由基的IC50值0.004 g·L-1)小于總黃酮IC50值0.24 g·L-1)；朱砂蓮總多酚與總黃酮濃度與還原能力和DPPH自由基清除率之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，朱砂蓮中抗氧化活性物質(zhì)主要是酚類和黃酮類成分，且朱砂蓮總多酚和總黃酮均具有較強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力，是天然的自由基清除劑和抗氧化活性劑。