枸櫞酸西地那非原料藥新的未知雜質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與合成

李淑恒, 宋煜偉，申鵬翠, 董靜靜, 潘會歌

(1.新鄉(xiāng)制藥股份有限公司 藥物研究所,河南 新鄉(xiāng) 453000;2. 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，河南 洛陽 471000)

枸櫞酸西地那非藥品標準已經(jīng)列入歐洲藥典(EP),美國藥典(USP)和印度藥典(IP)，目前明確了的有關(guān)物質(zhì)2有：合成工藝控制中殘留的3個有關(guān)物質(zhì)，分別為1-甲基-3-丙基-4-氨基吡唑-5-甲酰胺(鹽酸鹽)，1-甲基-3-丙基-4-(2-乙氧基苯甲?；?吡唑-5-甲酰胺(Ⅰ)，1-甲基-3-丙基-5-(2-乙氧基苯基)-6,7-二氫-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅱ)。藥典規(guī)定的其他有關(guān)物質(zhì)有：5-[(2-乙氧基-5-(4-甲基哌嗪-1-磺?；?苯基]-1-甲基-3-(2-甲基丙基)-1,6-二氫吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅲ)，3-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氫-1H-吡唑并[4,4-d]嘧啶-5-基)苯磺酸(Ⅳ)，1-[(4-乙氧基-3-[5-(6,7-二氫-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶)]苯磺酸基〗-4-甲基哌嗪-4-氧化物(Ⅴ)，5-[(2-羥基-5-(4-甲基哌嗪-1-磺?；?苯基]-1-甲基-3-丙基-1,6-二氫吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅵ)，結(jié)構(gòu)式詳見圖1。

在我公司枸櫞酸西地那非的實驗中，高效液相色譜檢測枸櫞酸西地那非過程中，存在一個未知雜質(zhì)(以下均簡稱Imp2-1)，此雜質(zhì)非圖1所示的有關(guān)物質(zhì)，并且作為枸櫞酸西地那非原料藥的最大單雜存在，高于藥典規(guī)定的單雜控制限度。因此對Imp2-1的研究以此展開,確保藥物安全有效，對該雜質(zhì)的定性與含量控制應(yīng)受到重視。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2695質(zhì)譜聯(lián)用儀及empower 數(shù)據(jù)處理工作站(美國沃特世科技有限公司)；核磁共振儀bruker DPX-40M(德國布魯克科技有限公司)；perkin elmer spectrum two紅外光譜儀(鉑金埃爾默公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

圖1 有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果

Fig.1 structures of related substance

1-甲基-3-正丙基-4-氨基吡唑-5-甲酰胺鹽酸鹽(鹽酸鹽)、氯磺酸、N-甲基哌嗪、乙酸乙酯、三乙胺、氫氧化鉀、無水乙醇、碳酸氫鈉、一水合檸檬酸、二氯甲烷、色譜級乙腈、色譜級甲醇、去離子超純水。

1.2 枸櫞酸西地那非原料藥的合成工藝

枸櫞酸西地那非原料藥的合成方法報道較多[3-11]。方法大同小異，必需原料與反應(yīng)路徑相同。

一般的合成方法如圖2：(1)將鹽酸鹽、乙酸乙酯，三乙胺投入反應(yīng)瓶， 10℃以下慢慢滴加鄰乙氧基苯甲酰氯，抽濾干燥得Ⅰ。(2)將Ⅰ、氫氧化鉀和無水乙醇投入三頸燒瓶回流，反應(yīng)液降至室溫鹽酸調(diào)節(jié)pH值至 ，抽濾干燥得Ⅱ。 (3)將氯磺酸滴加入反應(yīng)瓶， 10℃以下分批緩慢加入Ⅱ， 30℃反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水和二氯甲烷的混合液中攪拌分層，有機相Ⅳ收入反應(yīng)瓶中，滴加N-甲基哌嗪，反應(yīng)液用飽和碳酸氫鈉溶液、去離子超純化水分別萃取一次，有機相減壓蒸餾得西地那非。酸，乙醇，西地那非至三頸燒瓶中回流，降溫結(jié)晶抽濾，得枸櫞酸西地那非粗品。枸櫞酸西地那非粗品經(jīng)活性炭， %乙醇回流精制，得枸櫞酸西地那非成品。

圖2 枸櫞酸西地那非的合成路線

Fig.2 Synthetic Route of sildenafil citrate

1.3 Imp2-1的研究

在該合成工藝下，枸櫞酸西地那非成品中檢測出雜質(zhì)Imp2-1，液相百分比高于0.1%。在本研究發(fā)現(xiàn)Imp2-1之前，依據(jù)歐洲藥典中所列的枸櫞酸西地那非有關(guān)物質(zhì)檢測項下的HPLC條件，在該HPLC條件下，Imp2-1保留時間靠后而未被檢測出，為此本研究制定了一個針對Im2-1的HPLC條件。經(jīng)過HPLC保留時間對比，Imp2-1在中間體Ⅱ中已經(jīng)存在(含0.2%左右，見圖3)，經(jīng)過后續(xù)第3步反應(yīng)，生成產(chǎn)物Ⅳ的二氯甲烷萃取液中，Imp2-1在薄層色譜上清晰可見。在第3步反應(yīng)的基礎(chǔ)上，Ⅱ在改變氯磺酸用量以及反應(yīng)溫度的體系中，所得產(chǎn)物Ⅳ中，Imp2-1的液相百分比可提升至15%，接著對Ⅳ進行質(zhì)譜分析，得Imp2-1分子質(zhì)量為346.9。由于第2步與第 步反應(yīng)產(chǎn)物都存在Imp2-1，而兩步反應(yīng)唯一相同的元素為體系里都含有氯化氫(氯磺酸分解產(chǎn)生H2SO4和HCl)。最終推測出Imp2-1的結(jié)構(gòu)可能為5-(5-氯-2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1,6-二氫-7H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7-酮。

圖3 Imp2-1和中間體Ⅱ HPLC峰綜合報告

Fig.3 Peak Comprehensive Report of HPLC of Imp2-1 and Ⅱ

2 Imp2-1的合成及結(jié)構(gòu)表征

2.1 Imp2-1的合成

具體的合成方法如圖4：將10gⅡ、100mL氯仿投入三口瓶1中，加入1mL氯磺酸攪拌均勻；10g高錳酸鉀投入三頸燒瓶2中，恒壓滴液漏斗中加入60mL鹽酸裝與三頸燒瓶2，三頸燒瓶1與三頸燒瓶2之間連起通氣管，通氣管口應(yīng)沒入氯仿液面以下，設(shè)備準備完畢，開啟鹽酸滴注，觀察三口瓶1的氣泡，確定鹽酸滴注速度，同時開啟攪拌并加熱回流三頸燒瓶1。當(dāng)不再有氯氣氣泡產(chǎn)生時停止反應(yīng)。用水萃取，減壓蒸餾有機相，乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥得產(chǎn)物1g，液相純度達97%以上。通過液相保留時間與質(zhì)譜對比，確認得到的產(chǎn)物為5-(5-氯-2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1,6-二氫-7H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7-酮。在沒有氯磺酸存在的體系中，直接通入氯氣，并不能得到Imp2-1。

圖4 Imp2-1的合成路線

2.2 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征

Imp2-1的NMR見表1，IR spectra見圖5，LS-MS見圖6。

表1 Imp2-1的核磁數(shù)據(jù)

Tab.1 NMR of Imp2-1

圖5 Imp2-1的紅外圖譜

圖6 Imp2-1的液相質(zhì)譜

2.3 Imp2-1的普遍性

在對Imp2-1研究的同時，我們也購入了其他公司生產(chǎn)的枸櫞酸西地那非，其他廠家的產(chǎn)品也同樣存在Imp2-1(圖7，還有其他廠家的樣品同樣含有Imp2-1，由于大量圖譜的名稱以代碼形式顯示 不具有代表性而未在此圖列出)。因為HPLC進樣方法采用點樣，枸櫞酸西地那非主峰高不同，但是已經(jīng)超出了藥典規(guī)定的有關(guān)物質(zhì)檢測濃度，不影響有關(guān)物質(zhì)及Imp2-1的含量檢測。圖中可見，其他廠家的Imp2-1明顯存在，可見大部分生產(chǎn)廠家也是在本文列出的工藝下生產(chǎn)的。本公司實驗室小試產(chǎn)品為枸XDNF2#，通過工藝改進(工藝涉嫌機密，無法列出)，已將Imp2-1徹底除去，并將Imp2-1列入了枸櫞酸西地那非成品的質(zhì)量標準中加以控制。

圖7 枸櫞酸西地那非HPLC峰綜合報告

Fig.7 Peak Combrehensive Report of HPLC sildenafil citrate

3 總結(jié)

Imp2-1未見報道，研究表明Imp2-1是由體系中存在HCl而產(chǎn)生的,而氯磺酸是工藝中必不可少的原料，氯磺酸自身在其磺化反應(yīng)過程中會產(chǎn)生大量HCl。由此可以推論在有氯磺酸作為原料參與的枸櫞酸西地那非合成工藝中，必然會產(chǎn)生Imp2-1。若Imp2-1無法有效的除去，會摻雜在枸櫞酸西地那非成品中，影響枸櫞酸西地那非原料藥純度以及可能作為藥品在人體引起毒副作用。故Imp2-1應(yīng)作為雜質(zhì)定入枸櫞酸西地那非成品的質(zhì)量標準中控制其含量，保證藥品的質(zhì)量安全。