透骨祛痹方抗炎鎮(zhèn)痛作用與急性毒性試驗(yàn)研究

周雅琪，蔣 林，郭勇秀，隨家寧，魏博偉，李芳嬋

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

透骨祛痹方是治療膝關(guān)節(jié)滑膜炎的壯藥驗(yàn)方，由三加皮、滇白珠、常春衛(wèi)矛、石南藤、青風(fēng)藤等十味藥組成，具有祛風(fēng)清熱、利水除濕、消腫止痛、強(qiáng)筋健骨的功效，治療膝關(guān)節(jié)滑膜炎療效顯著且安全可靠。本課題組前期已對(duì)透骨祛痹方進(jìn)行了提取工藝考察，確定了最佳提取工藝。為進(jìn)一步探索透骨祛痹方的作用機(jī)理為臨床使用提供藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)研究透骨祛痹方乙醇提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其急性毒性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 KM小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào):SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物購入后，飼養(yǎng)于空調(diào)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，喂顆粒標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水和攝食，保持清潔。

1.2 藥物與試劑 三加皮采自廣西壯族自治區(qū)防城港，滇白珠、常春衛(wèi)矛、五指毛桃、石南藤、青風(fēng)藤、海桐皮、防己、薏苡仁、三白草根均購自玉林藥材市場，所有藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟老師鑒定，均符合藥典要求。阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號(hào):H20065051）；角叉菜膠（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào):524C051）；瓊脂（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào):731U022）；甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào):2018072001）；乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào):10009218）；生理鹽水［回音必集團(tuán)（江西）東亞制藥有限公司，批號(hào):2018072914］；冰醋酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20160606）；小鼠前列腺素 E2（PGE2）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào):201605）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 智能熱板鎮(zhèn)痛儀（成都泰盟軟件有限公司）；98-I-B型電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SQP型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；752型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1780，日本島津儀器有限公司）；水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 透骨祛痹方乙醇提取物的制備 按照透骨祛痹方處方比例稱取藥材，加入50%乙醇回流提取2次，每次90 min，過濾，合并濾液后回收乙醇，濃縮，制得浸膏備用，每克浸膏含11.43 g生藥。

2.2 抗炎試驗(yàn)

2.2.1 角叉菜膠致小鼠足腫脹試驗(yàn)［1-2］取KM小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為模型組、阿司匹林組（予阿司匹林50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低劑量組（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每組8只。用藥組每天灌胃給藥1次，模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d，末次灌胃30 min后，所有小鼠右后足皮下注射1%角叉菜膠0.03 ml致炎，4 h后脫頸椎處死各小鼠，于膝關(guān)節(jié)處剪下炎足，稱重，將其充分剪碎，于2 ml生理鹽水中浸泡1 h，3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清液0.25 ml，加入0.5 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2 ml，于50℃恒溫水浴鍋水浴20 min后加入5 ml甲醇稀釋，以酶聯(lián)免疫吸附法測定PGE2的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.2 瓊脂肉芽致小鼠炎癥試驗(yàn)［3］取KM小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為模型組、阿司匹林組（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低劑量組（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每組8只。所有小鼠均在背部皮下注射2%瓊脂，每只0.3 ml，用藥組于第二天開始連續(xù)用藥7 d，模型組給予等體積生理鹽水，第8天將小鼠脫頸椎處死，剝離瓊脂肉芽塊，并稱濕重，并計(jì)算腫脹抑制率，抑制率=（模型組瓊脂肉芽重量－給藥組瓊脂肉芽重量）/模型組瓊脂肉芽重量×100%。

2.2.3 對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響［4］取KM小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為模型組、阿司匹林組（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低劑量組（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg），每組8只。給藥組每天灌胃給藥1次，模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，每只小鼠按10 ml/kg腹腔注射0.8%醋酸溶液，立即觀察并記錄15 min內(nèi)各組小鼠的扭體次數(shù)，以扭體次數(shù)作為痛反應(yīng)指標(biāo)，并計(jì)算藥物對(duì)扭體反應(yīng)的抑制率。

2.2.4 對(duì)熱板致痛反應(yīng)的影響［5］取KM雄性小鼠50只，實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于智能熱板儀55.0±0.5℃進(jìn)行篩選，以小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期為痛閾指標(biāo)，選取反應(yīng)潛伏期在8～30 s的合格雄性小鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為空白組、阿司匹林組（50 mg/kg）及透骨祛痹方醇提取物高、中、低劑量組（0.66 mg/kg、0.33 mg/kg、0.17 mg/kg）?？瞻捉M給予等體積生理鹽水，給藥組連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。分別測定給藥前及末次給藥后30 min、60 min、90 min各鼠的痛閾值。將每只小鼠正常痛閾值各測2次，每次間隔5 min，取其平均值為給藥前正常痛閾值，比較同組給藥后不同時(shí)間平均痛閾與基礎(chǔ)痛閾的差異，判斷是否有鎮(zhèn)痛作用。

2.3 急性毒性試驗(yàn) 按LD50方法［5］測定。由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知透骨祛痹方醇提取物致100%動(dòng)物死亡劑量（5.035 mg/kg）和0%動(dòng)物死亡劑量（1.1925 mg/kg）。取KM小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組（5.0350mg/kg、2.5175 mg/kg、1.1925 mg/kg共3個(gè)劑量組）。小鼠禁食不禁水12 h后，按40 ml/kg灌胃給予透骨祛痹方醇提取物，1次/天。給藥后連續(xù)觀察14 d，并記錄小鼠毒性反應(yīng)、死亡數(shù)和死亡情況，用Bliss法計(jì)算LD50及95%置信區(qū)間。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響 見表1。

表1 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠炎癥組織中PGE2含量的影響

表1 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠炎癥組織中PGE2含量的影響

注:與模型組比較，①P＜0.05

n 8 8 8 8 8劑量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17 PGE2含量（μmol/L）1.20±0.11 0.98±0.12①0.94±0.31①0.96±0.19①0.99±0.14①組 別模型組阿司匹林組透骨祛痹方醇提取物高劑量組透骨祛痹方醇提取物中劑量組透骨祛痹方醇提取物低劑量組

由表1可知，與模型組比較，透骨祛痹方乙醇提取物高、中、低劑量組和阿司匹林組均可不同程度降低角叉菜膠致炎小鼠組織中PGE2含量（P＜0.05）。

3.2 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠瓊脂肉芽腫的影響 見表2。

表2 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠瓊脂肉芽腫的影響

表2 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠瓊脂肉芽腫的影響

注:與模型組比較，①P＜0.01；與阿司匹林組比較，②P＜0.01

n 8 8 8 8 8劑量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17肉芽腫重量（mg）0.17±0.018 0.13±0.019①0.08±0.037①②0.13±0.018①0.16±0.023抑制率（%）－21.32 52.94 22.06 4.41組 別模型組阿司匹林組透骨祛痹方醇提取物高劑量組透骨祛痹方醇提取物中劑量組透骨祛痹方醇提取物低劑量組

由表2可知，與模型組比較，透骨祛痹方乙醇提取物高、中劑量組和阿司匹林組對(duì)小鼠瓊脂肉芽腫炎癥均有顯著抑制作用（P＜0.01），且高劑量組作用優(yōu)于阿司匹林組（P＜0.01）。

3.3 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響 見表3。

表3 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

表3 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

注:與模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與阿司匹林組比較，③P＜0.05

n 8 8 8 8 8劑量（mg/kg）－50 0.66 0.33 0.17扭體次數(shù)28.91±9.49 19.02±6.26①11.40±3.74②③17.14±6.06②③23.07±9.56扭體抑制率（%）—34.21 60.61 40.70 20.36組 別模型組阿司匹林組透骨祛痹方醇提取物高劑量組透骨祛痹方醇提取物中劑量組透骨祛痹方醇提取物低劑量組

由表3可知，與模型組比較，透骨祛痹方乙醇提取物高、中劑量組和阿司匹林組均能明顯減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05或P＜0.01）。與阿司匹林組比較，透骨祛痹方醇高、中劑量組的作用更明顯（P＜0.05）。

3.4 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)熱板致痛閾值的影響 見表4。

表4 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)熱板致痛閾值的影響

表4 透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)熱板致痛閾值的影響

注:與空白組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別空白組阿司匹林組透骨祛痹方醇提取物高劑量組透骨祛痹方醇提取物中劑量組透骨祛痹方醇提取物低劑量組n 88888劑量（mg/kg）—0.05 0.66 0.33 0.17給藥前痛閾值（s）16.04±3.58 16.24±5.75 15.91±6.82 16.26±3.69 16.05±4.27給藥后痛閾值（s）30 min 16.34±6.97 32.05±12.93②34.40±4.88②31.09±16.41②26.50±8.43①60 min 17.36±4.68 39.25±12.30②60.91±18.41②40.12±16.58②35.42±13.39②90 min 17.78±11.23 48.25±11.77②67.79±9.97②46.59±10.71②41.59±13.72②

由表4可知，與空白組相比，給藥前各組痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；透骨祛痹方乙醇提取物高、中、低劑量組和阿司匹林組給藥后30 min、60 min、90 min均可明顯提升熱板所致小鼠痛閾值（P＜0.05或P＜0.01）。

3.5 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 在給藥后2 h內(nèi)，小鼠未表現(xiàn)異常、死亡等情況。在給藥20 h內(nèi)，小鼠出現(xiàn)不同程度的蜷伏、毛發(fā)疏松、身體冰涼、活動(dòng)減少、飲食減少等狀況，給予5.035 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠全部死亡，給予2.5175 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠死亡數(shù)量為10只，給予1.1925 mg/kg透骨祛痹方醇提取物的20只小鼠全部存活。給藥3天后，存活的小鼠活動(dòng)正常，飲食正常。透骨祛痹方乙醇提取物對(duì)小鼠灌胃的LD50為3.1095 mg/kg（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.02726），LD50的95%置信區(qū)間為2.7497～3.5164 mg/kg。

4 討論

膝關(guān)節(jié)滑膜炎是中老年患者常見的臨床疾病，以疼痛、腫脹為常見癥狀。利用抗炎鎮(zhèn)痛藥物治療本病是目前的主要手段。角叉菜膠致小鼠足腫脹是經(jīng)典的急性炎癥模型。角叉菜膠是從海藻中提取的一種含硫酸多糖物質(zhì)，將其注射到小鼠后肢足跖部皮下，能使局部毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管通透性增高、滲出、水腫，產(chǎn)生一系列急性炎癥的反應(yīng)，常用于評(píng)價(jià)或篩選藥物抗炎作用，在新藥評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛［6-9］。熱板法是物理性疼痛刺激引起的應(yīng)激組織反應(yīng)，而醋酸扭體法是化學(xué)刺激物注入小鼠腹腔內(nèi)引起的疼痛刺激反應(yīng)，這兩種方法是中樞鎮(zhèn)痛和外周鎮(zhèn)痛的經(jīng)典模型，是評(píng)價(jià)和篩選鎮(zhèn)痛藥的常用模型［5，10］。本實(shí)驗(yàn)采用角叉菜膠致小鼠足腫脹急性炎癥和背部皮下注射瓊脂肉芽慢性炎癥模型，研究透骨祛痹方醇提取物的抗炎作用，采用醋酸扭體法和熱板鎮(zhèn)痛法觀察透骨祛痹方醇提取物的鎮(zhèn)痛作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，透骨祛痹方醇提取物可顯著抑制瓊脂致小鼠肉芽腫；可顯著抑制角叉菜膠致小鼠足跖腫脹，降低腫脹組織中PGE2含量；提示抑制局部組織PGE2合成或釋放可能是其抑制炎癥的途徑之一。在鎮(zhèn)痛作用方面，透骨祛痹方醇提取物可明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，在給藥30 min、60 min、90 min后均可顯著提升熱板所致小鼠痛閾值，作用與阿司匹林組相當(dāng)。本方乙醇提取物的LD50為3.1095 mg/kg，表明具有一定的急性毒性作用。前期研究已證明透骨祛痹方主要含有有機(jī)酸、木脂素類和生物堿類成分，與其抗炎、鎮(zhèn)痛作用可能相關(guān)，本課題組將進(jìn)一步探索其具體作用機(jī)制。