帕金森病患者血清外泌體與腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變和認(rèn)知功能損害的關(guān)聯(lián)性研究

梁海云， 王 良， 杜秀蘭， 張 茂

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以震顫、僵硬和運動遲緩癥狀為特征性表現(xiàn)[1,2]，由于位于紋狀體的黑質(zhì)和軸突投影中的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞體的減少所致。目前認(rèn)為，精神障礙、認(rèn)知障礙和睡眠障礙等非運動癥狀會導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降或殘疾。既往研究證實，腦白質(zhì)病變可導(dǎo)致與智能活動相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路阻斷，進(jìn)而誘發(fā)阿爾茲海默病[3,4]，但腦白質(zhì)病變與帕金森患者認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)尚不明確。磁共振彌散張量成像(DTI)能定量測量腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)，在活體評估白質(zhì)的完整性[5,6]，當(dāng)腦白質(zhì)損傷改變了軸突的方向同一性，腦白質(zhì)的部分各向異性(FA)值將會降低。有研究指出，帕金森病癡呆患者腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化比非癡呆患者更甚[7,8]，提示腦白質(zhì)病變可能在帕金森病認(rèn)知功能損害方面發(fā)揮了重要作用。外泌體(exosomes)是一種由細(xì)胞主動分泌到胞外的膜性囊泡小體，多項研究指出外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元之間、神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間的通信作用，證實其在帕金森病等神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中起到重要作用。因此，本文探討不同認(rèn)知功能損害帕金森病患者血清外泌體和腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變與認(rèn)知功能損害的關(guān)聯(lián)性，以期為臨床診治提供一定參考?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 帕金森病組 共納入2013年1月-2015年12月?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診或住院的帕金森病患者60例，年齡(64.7±6.9)歲，男性32例，女性28例。A.入組標(biāo)準(zhǔn)：符合2013年歐洲神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟帕金森病診斷指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。(1)運動遲緩；(2)至少具備下列癥狀中一項：靜止性震顫、肌強直、姿勢平衡障礙；(3)具備下列3項條件者：病情逐漸加重、左旋多巴治療有顯效、病程4 y或以上。B.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)帕金森綜合征(包括：腦血管病、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、代謝性疾病、中毒、腦外傷、顱內(nèi)腫瘤等原因所致)；(2)合并重要臟器疾病(心臟病、肝腎疾病等)；(3)既往曾接受過腦深部電極刺激、立體定向腦深部核團(tuán)毀損等外科治療的原發(fā)性帕金森病患者；(4)合并嚴(yán)重精神疾病者；(5)無法進(jìn)行核磁共振掃描者；(6)抑郁自評量表標(biāo)準(zhǔn)分≥50者。C.分組：依據(jù)帕金森患者的認(rèn)知功能狀態(tài)分成3組。(1)帕金森病認(rèn)知功能正常組(PD-N)；(2)帕金森病合并輕度認(rèn)知功能障礙組(PD-M)；(3)帕金森病癡呆組(PDD)。

1.1.2 對照組 選擇同時期健康對照20例，性別、年齡及文化背景等資料與帕金森病組相匹配，按上述排除標(biāo)準(zhǔn)剔除不合標(biāo)準(zhǔn)對照組成員，對照組采用簡明精神狀態(tài)量表進(jìn)行心理評估，評分不低于26分。

1.2 方法 本研究采用問卷調(diào)查與臨床檢查相結(jié)合的方式，全體患者及健康對照組人員均經(jīng)知情同意告知，并簽字確認(rèn)。

1.2.1 一般信息調(diào)查 主要包含受調(diào)查者的個人背景資料-即年齡、性別、民族、發(fā)病時間、治療經(jīng)歷及效果等。

1.2.2 采用《統(tǒng)一帕金森病評分量表(UPDRS)》和《帕金森病Hoehn-Yahr(修正)分級量表》對全部帕金森患者病情進(jìn)行評估。

1.2.3 采用中文版《簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)》評估帕金森病組和對照組的認(rèn)知功能狀態(tài)[9,10]。該量表包括以下11項：時間定向力、注意力及計算力、語言理解力、即刻記憶、短程記憶、物體命名、言語復(fù)述、閱讀理解、語言表達(dá)及圖形描畫共11項，共30項題目，每項回答正確得1分，回答錯誤或答不知道評0分，量表總分范圍為0～30分。測驗成績與文化水平密切相關(guān)，正常界值劃分標(biāo)準(zhǔn)為：未受教育者<17分，受教育年限低于6 y者<20分，受教育年限6 y以上者<24分，提示受試者有認(rèn)知功能受到損害。

1.2.4 采用《蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)》對患者認(rèn)知功能損害進(jìn)行評估[9,10]MoCA量表分別從交替連線測驗、視空間與執(zhí)行功能(立方體、鐘表)、命名、記憶、注意、句子復(fù)述詞語流暢性、抽象、延遲回憶和定向這11項檢查內(nèi)容對人的8個認(rèn)知領(lǐng)域(包括注意與集中、執(zhí)行功能、記憶、語言、視結(jié)構(gòu)技能、抽象思維、計算和定向力)進(jìn)行評估。如果受試者受教育年限不足12 y，則在測試結(jié)果上加1分用來校正受教育程度的偏倚，得分越高認(rèn)知功能越好。評分低于26分時代表受試者已發(fā)生認(rèn)知功能損害。全部測試由受試者自己獨立完成。

1.2.5 磁共振彌散張量成像(Diffusion tensor imaging,DTI) 采用GE 3.0 T核磁共振儀進(jìn)行頭部檢查，對全部檢測對象進(jìn)行頭部核磁共振常規(guī)序列和彌散張量成像序列掃描。DTI序列包含16個方向，共采集(44×16)層，軸位掃描層面平行于前、后聯(lián)合的連線(AC-PC線)。DTI數(shù)據(jù)在AW 4.4計算機工作站上運用Functool圖像分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對不同感興趣腦區(qū)(region of interest,ROI)的腦白質(zhì)神經(jīng)纖維進(jìn)行各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy,FA)值的測量，包括：額(頂、顳、枕)葉白質(zhì)、胼胝體膝部、胼胝體壓部、前(后)扣帶束等腦區(qū)雙側(cè)對稱部位選取ROI。

1.2.6 60例帕金森病患者和20例健康對照組，于晨起后空腹?fàn)顟B(tài)用EDTA及抗凝管經(jīng)肘正中靜脈抽取外周靜脈血6毫升，血液標(biāo)本采集30 min內(nèi)經(jīng)高速離心機1400轉(zhuǎn)/min，4 ℃離心15 min，取上清液存放于-80 ℃冰箱，以備酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測。應(yīng)用ELISA測定血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量，檢測試劑盒由上海希美化學(xué)有限公司提供，所有操作均參照說明書。

2 結(jié) 果

2.1 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者及對照組一般情況 PD-N組、PD-M組、PDD組及對照組在年齡和性別分布之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PD-N組、PD-M組和PDD組帕金森患者在不同認(rèn)知功能狀態(tài)分組間的病程年限的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；帕金森病組患者統(tǒng)一的帕金森病評定量表(UPDRS)評分分別為PD-N組(31.3±11.2)分、PD-M組(44.2±14.5)分、PDD 組(57.4±16.2)分，顯示患者UPDRS隨認(rèn)知功能障礙加重病情呈逐漸加重趨勢(P<0.05)。Hoehn-Yahr分級分別為PD-N組(2.3±0.8)級、PD-M組(2.9±0.8)級、PDD 組(3.7±0.9)級，顯示患者Hoehn-Yahr分級隨認(rèn)知功能障礙加重病情呈逐漸加重趨勢(P<0.05)(見表1)。

2.2 中晚期帕金森病與早期之間認(rèn)知功能狀態(tài)分布情況 我們根據(jù)帕金森病患者Hoehn-Yahr分級，將60例帕金森患者分為兩組，即早期帕金森病組：Hoehn-Yahr分級1～2級，共30例(男性17例，女性13例)；中晚期帕金森組：Hoehn-Yahr分級3～5級，30例(男性15例，女性15例)。兩組性別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.94，P<0.05)。對比兩組之間認(rèn)知功能損害的差異，結(jié)果(見表2)。在早期帕金森病組中，50.0%患者認(rèn)知功能正常，34.5%患者伴有輕度認(rèn)知功能損害，11.3%患有帕金森癡呆；而中晚期帕金森病組中，16.7%患者認(rèn)知功能正常，30.0%患者伴有輕度認(rèn)知功能損害，51.3%患有帕金森癡呆。中晚期組帕金森癡呆者所占比例顯著高于早期組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而中晚期組認(rèn)知功能正常者所占比例顯著低于早期組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者和健康對照組MoCA總分和MMSE總分比較 帕金森病組《蒙特利爾認(rèn)知評估量表(MoCA)》總分分別為：PD-N組(22.2±4.2)分、PD-M 組(19.2±5.1)分、PDD 組(15.9±5.2)分，顯示患者M(jìn)oCA總分隨認(rèn)知功能障礙加重病情呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。帕金森病組《簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)》總分分別為：PD-N組(25.3±2.8)分、PD-M 組(24.3±4.8)分、PDD 組(21.7±5.9)分，顯示患者M(jìn)MSE總分隨認(rèn)知功能障礙加重病情呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組MoCA和MMSE總分相比帕金森病組均呈顯著下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以MMSE量表作為帕金森患者認(rèn)知功能評估標(biāo)準(zhǔn)時，60例患者中24例異常，占帕金森患者總數(shù)的40.0%；以MoCA量表作為帕金森患者認(rèn)知功能評估標(biāo)準(zhǔn)時，60例患者中45例異常，占帕金森患者總數(shù)的75.0%。在36例MMSE總分正常的帕金森患者中，有21例MoCA總分異常，占MMSE總分正常的帕金森患者58.3%。此結(jié)果提示在對帕金森患者認(rèn)知功能損害進(jìn)行評估時，MoCA量表篩查的敏感性要優(yōu)于MMSE量表，而后者的特異性則可能更高(見表3)。

2.4 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者和健康對照組腦白質(zhì)FA值變化 與對照組比較，帕金森病癡呆組(PDD)和帕金森病合并輕度認(rèn)知功能障礙組(PD-M)患者的左額葉白質(zhì)、右顳葉白質(zhì)及雙側(cè)前扣帶束白質(zhì)的FA值下降；PD-M組的左顳葉白質(zhì)和胼胝體膝部的FA值下降； PD-N組的左枕葉白質(zhì)和左前扣帶束的FA值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 PDD組左扣帶前束和胼胝體壓部白質(zhì)的FA值低于PD-M組、PD-N組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過比較發(fā)現(xiàn)PD-M組右顳葉、右后扣帶束及胼胝體膝部等腦區(qū)白質(zhì)的FA值低于PD-N組相依區(qū)域的FA值，將這兩組有統(tǒng)計學(xué)差異的腦白質(zhì)區(qū)域FA值、患者UPDRS評分和Hoehn-Yahr分級結(jié)果納入Logistic回歸方程，結(jié)果顯示胼胝體膝部腦白質(zhì)FA值的下降仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過比較發(fā)現(xiàn)PDD組左枕葉、左前扣帶束及胼胝體壓部等腦區(qū)白質(zhì)的FA值低于PD-N組相依區(qū)域的FA值，將這兩組有統(tǒng)計學(xué)差異的腦白質(zhì)區(qū)域FA值、患者UPDRS評分和Hoehn-Yahr分級結(jié)果納入Logistic回歸方程，結(jié)果顯示左側(cè)扣帶前束腦白質(zhì)FA值的下降仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同區(qū)域腦白質(zhì)與帕金森認(rèn)知功能狀態(tài)的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果如下：左額葉(r=-0.343,P<0.05)、右顳葉(r=-0.393,P<0.05)、左枕葉(r=-0.231,P<0.05)、左扣帶前束(r=-0.396,P<0.05)、右扣帶前束(r=-0.241,P<0.05)、胼胝體壓部(r=-0.236,P<0.05)(見表4)。

2.5 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森病患者和健康對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白對比 對60例帕金森病患者和20例正常對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。帕金森病各組(PD-N、PD-M、PDD)血清TNF-α及α-突觸核蛋白濃度水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)；PD-N、PD-M及PDD組組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，隨患者認(rèn)知功能損害逐漸加重呈遞增狀態(tài)。對60例帕金森病患者血清α-突觸核蛋白濃度與帕金森認(rèn)知功能狀態(tài)分級進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果如下：帕金森認(rèn)知功能正常(r=0.446,P<0.05)、帕金森病合并輕度認(rèn)知功能障礙(r=0.492,P<0.05)、帕金森癡呆(r=0.432,P<0.05)。血清TNF-α濃度與帕金森認(rèn)知功能狀態(tài)分級進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果如下：帕金森認(rèn)知功能正常(r=0.382,P<0.05)、帕金森病合并輕度認(rèn)知功能障礙(r=0.414,P<0.05)、帕金森癡呆(r=0.378,P<0.05)(見表5)。

表1 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者及對照組一般資料對比

注：PD-N代表帕金森病認(rèn)知功能正常組;PD-M代表帕金森病輕度認(rèn)知功能障礙組;PDD代表帕金森癡呆組

表2 中晚期帕金森病與早期之間認(rèn)知功能狀態(tài)分布情況的比較

注：PD-N代表帕金森病認(rèn)知功能正常組;PD-M代表帕金森病輕度認(rèn)知功能障礙組;PDD代表帕金森癡呆組。中晚期帕金森病與早期之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P<0.05

表3 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者和健康對照組MoCA總分和MMSE總分對比

表4 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者和健康對照組腦白質(zhì)FA值對比

表5 不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森患者和健康對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白對比

3 討 論

帕金森病是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)生于中老年人，隨著老齡化社會的來臨，我國帕金森病的發(fā)病情況呈逐年遞增的趨勢。帕金森病多隨病程逐漸進(jìn)展，不僅表現(xiàn)運動癥狀的進(jìn)展，部分患者可伴發(fā)認(rèn)知功能損害、睡眠障礙等非運動性癥狀的進(jìn)展，造成家庭和社會負(fù)擔(dān)日益加深[11,12]。近年來關(guān)于帕金森病認(rèn)知功能損害機制的研究日益深入，但仍未取得突破性進(jìn)展，如何對帕金森病患者的認(rèn)知功能狀態(tài)做出更為準(zhǔn)確的評估，對容易發(fā)生認(rèn)知功能損害的患者進(jìn)行篩查和鑒別，早期進(jìn)行干預(yù)治療，減少或推遲認(rèn)知功能損害的發(fā)生成為研究的熱點和前沿。研究顯示富亮氨酸重復(fù)激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因突變能夠?qū)е屡两鹕〉陌l(fā)生，越來越多的證據(jù)表明，LRRK2可參與核內(nèi)體形成過程，包括與Ras癌基因家族的Rab5b結(jié)合后調(diào)控MVB與細(xì)胞質(zhì)膜的融合及外泌體分泌，該基因相關(guān)位點突變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的多泡體的異常聚集，并能夠誘導(dǎo)生成大量包含有毒性α-突觸核蛋白的外泌體[13]。通過外泌體的轉(zhuǎn)運后毒性α-突觸核蛋白進(jìn)入正常神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)毒性α-突觸核蛋白積聚以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞又可產(chǎn)生富含腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的外泌體，加劇神經(jīng)毒性，促進(jìn)帕金森病進(jìn)展[14,15]。神經(jīng)影像學(xué)的發(fā)展同樣有了很大進(jìn)展，通過磁共振彌散張量成像能夠較準(zhǔn)確的對腦白質(zhì)的神經(jīng)纖維完整性作出判斷，為認(rèn)知功能障礙的診斷提供了參考依據(jù)[16,17]。

本研究中利用磁共振彌散張量成像技術(shù)對腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變同帕金森病認(rèn)知功能的損害的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示帕金森患者并發(fā)癡呆之后其左額葉、右顳葉及雙側(cè)前扣帶束白質(zhì)的FA值下降，經(jīng)Logistic回歸分析胼胝體膝部腦白質(zhì)可能具有特異性；并發(fā)輕度認(rèn)知損害時左顳葉和胼胝體膝部的FA值下降，經(jīng)過Logistic回歸分析左側(cè)扣帶前束白質(zhì)可能具有特異性；不同區(qū)域腦白質(zhì)與帕金森認(rèn)知功能狀態(tài)的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果提示其間存在負(fù)相關(guān)，上述結(jié)果提示帕金森患者認(rèn)知功能損害越嚴(yán)重，上述相應(yīng)部位腦白質(zhì)的FA值降低越明顯。

本研究還對不同認(rèn)知功能狀態(tài)帕金森病患者血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示帕金森病各組血清TNF-α及α-突觸核蛋白濃度水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)，并且隨患者認(rèn)知功能障礙的加重程度呈遞增狀態(tài)。如表5所示。對帕金森病患者血清α-突觸核蛋白濃度與帕金森認(rèn)知功能狀態(tài)分級進(jìn)行Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示帕金森患者認(rèn)知功能損害越嚴(yán)重，血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量升高越顯著。兩者之間成正相關(guān)。此結(jié)果中α-突觸核蛋白在外周血內(nèi)含量升高能夠反映出外泌體對帕金森病進(jìn)展的影響。

綜上所述，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能損害在帕金森患者中發(fā)生率較高，通過MoCA量表檢測能夠?qū)φJ(rèn)知功能損害的帕金森患者進(jìn)行篩查，敏感度較高；磁共振彌散張量成像技術(shù)提示胼胝體膝部及左側(cè)扣帶前束白質(zhì)損害在帕金森病認(rèn)知功能障礙發(fā)生的診斷具有一定價值，血清外泌體內(nèi)含有較高的α-突觸核蛋白，與帕金森病認(rèn)知功能障礙發(fā)生具有一定關(guān)系。