循環(huán)腫瘤細胞研究進展

王建， 邵榮金， 龔偉達

1869年，Ashwort對1例癌癥死亡患者進行尸檢時發(fā)現(xiàn)其外周血存在類似的腫瘤細胞，首次提出了循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)這一概念[1]。CTC是指由癌灶組織細胞脫離原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞，進一步研究把CTC分為4類，單個游離的上皮樣 CTC、干細胞樣CTC、間質(zhì)樣CTC、CTC細胞簇。這部分細胞在腫瘤血行轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的早期事件[2]，而CTC可能是遠處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[2]。一般情況下，入血的腫瘤細胞往往被免疫細胞殺死，而有些處于休眠狀態(tài)的腫瘤細胞，可以逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，待患者免疫力較低或在某些刺激下再次復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移到遠處臟器存活并增殖，最終形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移癌灶[4]。有研究表明，CTC的半衰期只有1.0～2.4 h，僅有0.01%存活且具有侵襲性的CTC在合適環(huán)境下穿出血管定植于遠端形成轉(zhuǎn)移灶[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟多因素的復(fù)雜過程，而CTC的形成是實現(xiàn)腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。目前關(guān)于惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的機制存在兩種觀點，一種是“腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)理論”，認為原發(fā)癌灶中存在具有干細胞特性的腫瘤細胞，具有自我更新、單克隆增殖和分化的能力；另一種理論認為，惡性腫瘤的某些突變基因決定了腫瘤細胞的侵襲性，其遠處轉(zhuǎn)移和原發(fā)病灶的增殖同時進行[6]。對于已經(jīng)形成轉(zhuǎn)移灶的惡性腫瘤，由于腫瘤細胞異質(zhì)性，轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶的細胞可能存在不同的表型，而CTC不僅來源于腫瘤原發(fā)灶，還來源于轉(zhuǎn)移瘤灶，故CTC檢測能較好地反映機體腫瘤細胞類型的整體情況。

1 循環(huán)腫瘤細胞的生物學(xué)特征

CTC生物學(xué)行為與血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來，CTC與CSC間的關(guān)系已被研究證實[7-8]，提示CTC具有CSC的高度侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。CTC在外周循環(huán)血液的含量，可能受腫瘤細胞釋放入血的時間(隨機釋放或類似于激素分泌的周期性規(guī)律釋放[9])、人體免疫水平、腫瘤侵襲特性等因素的影響。腫瘤細胞侵襲入血包含以下幾個步驟：腫瘤細胞生長、新生血管形成、瘤細胞脫離瘤體、上皮樣-間葉樣細胞轉(zhuǎn)變(epithelial to mesenchymal transition，EMT)、癌細胞血管內(nèi)滲、細胞播散、癌細胞滯留于器官、滲出、增殖及遠處轉(zhuǎn)移灶形成；所以腫瘤新生血管及血管微環(huán)境對腫瘤轉(zhuǎn)移起著重要的作用[10]。CTC在穿過基底膜形成遠處轉(zhuǎn)移灶過程中，EMT形態(tài)的改變和重新獲得的增殖能力在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用且具有高度侵襲性。研究表明，發(fā)生EMT的CTC其上皮細胞標志物，如細胞角蛋白、鈣黏蛋白等表達下調(diào)，而間充質(zhì)細胞的標志物，如基質(zhì)金屬蛋白酶、彈性蛋白等顯著上調(diào)，這也是導(dǎo)致此類CTC生物學(xué)行為發(fā)生改變的重要原因。由于腫瘤細胞生存的微環(huán)境改變、血流剪切力的作用及外周血中免疫細胞的作用，絕大多數(shù)CTC發(fā)生凋亡，只有極少數(shù)細胞能存活下來并在合適條件下重新穿出血管，最終在適宜的器官形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移[11]。從模型估計每克腫瘤組織每天約1×106腫瘤細胞進入血液，有一部分凋亡CTC不能形成繼發(fā)器官的轉(zhuǎn)移[12]。

2 循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床意義

CTC檢測的臨床意義主要體現(xiàn)在以下幾個方面：① 早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移：Sastre等[13]用 CellSearch 系統(tǒng)監(jiān)測結(jié)腸癌患者，證實其CTC陽性率與原發(fā)腫瘤部位、腫瘤分化程度及CEA升高水平無關(guān)，但與結(jié)腸癌的臨床分期相關(guān)，且CTC在結(jié)腸癌的早期階段即可檢測到，表明CTC檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移；② 評估預(yù)后：Cristofanilli等[14]在一項多中心、前瞻性、隨機雙盲臨床試驗中，檢測177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者7.5 ml外周血中CTC的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)治療前外周血中CTC≥5個/7.5 ml外周血患者與CTC<5個/7.5 ml外周血患者相比，預(yù)后較差，CTC可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后評估的獨立預(yù)測因素；③ 指導(dǎo)個體化治療：CTC計數(shù)和分子分型不僅能精確地預(yù)測療效、判斷預(yù)后，而且還可作為一種實時活檢工具，為制定個體化治療方案提供依據(jù)[15]。Meng等[16]應(yīng)用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)，38%轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者原發(fā)腫瘤組織HER-2呈陰性，而分離并富集的外周血CTC能夠擴增到HER-2基因，根據(jù)CTC的HER-2擴增情況適時調(diào)整治療方案，能獲得更好的療效。監(jiān)控CTC的HER-2基因表達，進行個體化有針對性的治療是對乳腺癌患者傳統(tǒng)治療觀念的改進。

3 循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)

由于CTC在外周血的數(shù)量極其稀少，通常每1×106～1×107個單核細胞中才會發(fā)現(xiàn)一個CTC，因此對CTC檢測技術(shù)的靈敏度和特異度提出了極高要求。CTC檢測包括兩大技術(shù)環(huán)節(jié)，即細胞富集技術(shù)和細胞鑒定技術(shù)。

3.1 循環(huán)腫瘤細胞的富集技術(shù) ① 基于分子免疫學(xué)檢測技術(shù)，主要包括細胞檢測體系(CellSearch System)、CTC-Chip(微量CTC微流體硅芯片)、CTC-PCR、免疫磁性細胞分選儀(MACS)、AdnaTest癌細胞檢測系統(tǒng)、萊爾系統(tǒng)等，其中CellSearch系統(tǒng)于2004年通過美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準而上市，是目前唯一市場化用于CTC檢測的技術(shù)設(shè)備[17]。也是目前臨床和科研應(yīng)用最廣的方法。該技術(shù)的優(yōu)勢在于特異度較高，主要缺點是靈敏度不高，因上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象使上皮特異性抗原EpCAM、CKs 弱表達或不表達的腫瘤細胞容易被漏檢[18]。其工作原理用Ep-CAM標記磁珠對上皮細胞進行富集，細胞經(jīng)固定后用4，6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染料標記細胞核，CD45熒光抗體和CKB、CK18、CK19或CKmix熒光抗體標記細胞，結(jié)果分析在四色熒光顯微鏡下進行。將DAPI+、CD45-、CK+、Ep-CAM+細胞定義為CTC。根據(jù)磁性細胞分選策略不同，大致分為：陽性富集法和陰性富集法。前者是通過磁珠偶聯(lián)上皮細胞黏附分子(Ep-CAM)、細胞角蛋白(Cytokerins，CKs)等標志直接富集外周血中上皮來源的稀有細胞。由于陽性富集法主要利用腫瘤細胞的上皮細胞源性，故該方法只適用于EpCAM，Cytokerins，CKs表達量較高的腫瘤類型[19]，此外，該方法無法排除外周血良性上皮細胞的污染及被血小板包被的CTC等干擾所導(dǎo)致的假陽性和假陰性。陰性富集法是通過磁珠偶聯(lián)CD45等白細胞標志去除外周血白細胞而間接富集稀有上皮細胞[20]。此方法能夠避免因免疫磁珠運動造成的CTC被破壞，且不依賴CTC表面抗原表達，同時也不受EMT影響，但其步驟較多，CTC破碎率較高。②基于細胞密度的分離法，密度梯度離心法是利用配制的分離液密度將不同密度的細胞區(qū)分在不同區(qū)域。將外周血平鋪于分離介質(zhì)上層，離心作用加速密度大于分離液的細胞沉降，而密度小于分離液的細胞則聚集于分離液面上層，從而達到分離效果。常用的分離介質(zhì)密度為1.077 g/ml，紅細胞、粒細胞密度比其大，離心后會沉于管底；淋巴細胞和單核細胞密度小于或等于分離介質(zhì)，離心后會漂浮于分離介質(zhì)上層或懸浮于介質(zhì)中，腫瘤細胞也是留存于單核細胞富集層。有時候，腫瘤細胞會遷移入血漿成分，于是產(chǎn)生了新的改進技術(shù) OncoQuick[21]，即在梯度離心介質(zhì)上安置一層多空膜屏障，這樣可在離心前延滯血液樣本的循環(huán)腫瘤細胞擴散，減少了腫瘤細胞丟失。但是這樣得到的循環(huán)腫瘤細胞同大量白細胞和單核細胞混在一起，降低了后期鑒別CTC效率。此方法操作簡單，成本低廉，分離出的CTC仍有活性，便于后續(xù)研究。③基于CTC直徑大小的濾過膜分離法，以ISET系統(tǒng)為代表，ISET最早由Vona 等[22]提出，工作原理是CTC直徑一般>10 μm，而正常血細胞(包括紅細胞、白細胞)、淋巴細胞直徑一般<8 μm，因此利用孔徑為8 μm濾膜過濾預(yù)先固定的外周血后，體積較小的血細胞能被濾過而體積較大的CTC則截留富集在濾膜上。該方法的優(yōu)點是操作簡便、價格低廉、分離富集后的CTC仍保留活力，能用于FISH、PCR等后續(xù)研究。缺點在于有可能漏檢體積較小的腫瘤細胞，目前CTC形態(tài)學(xué)鑒定缺乏統(tǒng)一標準[23]。

3.2 循環(huán)腫瘤細胞的鑒定技術(shù) ① 免疫細胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC)，是目前評價CTC檢測方法“金標準”。通過特異性抗體與CTC特異性抗原(如CK、AFP等)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)和細胞化學(xué)呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量分析。該技術(shù)能較好地觀察細胞形態(tài)學(xué)并計數(shù)，缺點是敏感性低，只能從1×105～10×105個細胞中發(fā)現(xiàn)1個CTC，且可能由于腫瘤細胞特異抗原表達的不穩(wěn)定性造成假陰性結(jié)果。② 流式細胞分析法，應(yīng)用CTC特異性結(jié)合熒光顯色劑使CTC染色，再利用流式細胞儀進行分析，同時能測定細胞形態(tài)、DNA及蛋白質(zhì)含量，還能對CTC理化特性等多種參數(shù)進行分析。③ 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，是以腫瘤細胞表達特定的mRNA(正常外周血細胞不表達)來檢測CTC，當外周血中檢測到該mRNA時可間接提示CTC的存在。該法敏感性、特異性均較高，但其準確性受外周血樣本上皮細胞污染、假基因干擾及CTC標志物異常表達等因素影響。由于檢測過程需破壞CTC，因此無法對細胞進行計數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察。④ 激光掃描細胞計數(shù)法，利用高通量細胞分析儀，以激光為光源，具有圖像細胞儀及流式細胞儀的功能，通過連續(xù)掃描熒光顯微鏡自動分析圖像數(shù)據(jù)，可在較短時間內(nèi)(0.5～1.0 h)自動檢測5×104個細胞，并能對CTC內(nèi)部微結(jié)構(gòu)進行定性、定位及定量分析。⑤ 生物芯片技術(shù)，以懸浮陣列技術(shù)為代表，該法敏感性及特異性較高，也不需要大量血標本，可用于多種抗體聯(lián)合分離CTC，并能根據(jù)CTC分子表型更精確分離CTC，對后續(xù)研究提供方便，但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本較高，限制其在臨床開展。⑥ 形態(tài)學(xué)鑒定，根據(jù)腫瘤細胞與正常細胞的形態(tài)學(xué)差異來鑒定CTC。該方法能較好地觀察細胞形態(tài)學(xué)且結(jié)果易于長期保存，但目前CTC的鑒定較大程度依賴于病理學(xué)醫(yī)生的經(jīng)驗，尚無形態(tài)學(xué)診斷金標準[24]。

此外，還有報道應(yīng)用單細胞全基因組測序技術(shù)，在單細胞水平上對CTC進行全基因組擴增并測序從而分析CTC的基因突變或基因組異常[25]。通過腺病毒攜帶GFP的標記技術(shù)，結(jié)合端粒酶標志，能通過生物影像技術(shù)檢測外周血中具有活性的CTC[26]。應(yīng)用上皮免疫斑點法，檢測CTC在短時間體外培養(yǎng)中所分泌或釋放的特異性蛋白質(zhì)，從而評估CTC的生物學(xué)功能[27]。

4 循環(huán)腫瘤細胞的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 循環(huán)腫瘤細胞檢測評估患者病情及預(yù)后 研究表明，CTC可成為一種新的診斷工具，更早為腫瘤的分期、預(yù)后(較少的CTC預(yù)示著較長的生存期)以及療效的評估提供信息。CTC檢測作為一種非侵入性檢查方法，還可對原發(fā)部位腫瘤和轉(zhuǎn)移部位腫瘤的生物學(xué)特性提供信息。在前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝細胞癌、膀胱癌等一系列實體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)存在CTC，CTC正成為腫瘤患者預(yù)后和對治療反應(yīng)的獨立預(yù)測因素[28-31]。在乳腺癌方面，CTC的數(shù)目(以≥5個CTC/7.5 ml外周血為閾值)已證實是獨立預(yù)后指標，可很好地預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的無進展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)。對于接受一線治療的結(jié)直腸癌患者，CTC在治療前后的數(shù)量變化可作為患者PFS和OS預(yù)測指標[32]，但對于接受三線治療的晚期結(jié)直腸癌患者，CTC數(shù)量變化僅可作為OS預(yù)測指標，而對PFS預(yù)測意義不大，≤3個CTC/7.5 ml外周血的患者OS更長[33]。對于接受一線化療的進展期胃食管腺癌患者，Sclafani[34]等的研究表明，外周血≥2個CTC的患者對化療反應(yīng)較差、生存時間更短。相比于傳統(tǒng)影像學(xué)而言，CTC檢測相對時間更早，結(jié)果也更準確[35]。

4.2 循環(huán)腫瘤細胞檢測用于選擇制定個體化治療方案 隨著人們對CTC分子生物學(xué)特性研究的不斷開展，CTC檢測已不局限于惡性腫瘤的無創(chuàng)診斷和預(yù)后預(yù)測，更重要的是可用于指導(dǎo)制定個體化的治療方案。近期有學(xué)者在轉(zhuǎn)移性乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，只有組織和CTC的HER-2均為陽性的患者才能從抗HER-2治療中獲益。相反，高達51.9%患者CTC的HER-2為陰性，而這些患者不太可能從抗HER-2治療中獲益[36]。因此，通過分析CTC分子分型，為腫瘤患者選擇個體化治療方案提供依據(jù)。Meyer等[35]研究表明，對于早期乳腺癌患者，31%患者外周血CTC陽性，且外周血CTC數(shù)量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積大小、腫瘤分級、腫瘤組織學(xué)類型和激素受體狀態(tài)都沒有明顯的關(guān)系；在患者接受治療后，大部分CTC陽性患者CTC轉(zhuǎn)陰，目前惡性腫瘤患者治療期間CTC數(shù)目的動態(tài)變化，已作為評價當前療效與患者病情進展的良好指標。Kalykaki等[38]在吉非替尼治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者研究中發(fā)現(xiàn)，治療第2個周期后，約70.6%患者CTC計數(shù)減少了94.1%，證明吉非替尼治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的有效性。Gabriel 等[39]針對430例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在治療后3～5周檢測CTC，發(fā)現(xiàn)治療后疾病進展患者中CTC≥3個/7.5 ml者占73%，而治療后疾病穩(wěn)定或好轉(zhuǎn)者中僅7%患者CTC≥3個/7.5 ml，同時指出CTC評價療效的準確性達到78%。影像學(xué)和CTC聯(lián)合檢測能更好地對患者生存進行評估預(yù)測。Mark等[40]觀察了不同分期的結(jié)直腸癌患者CTC表達譜的系統(tǒng)性變化。90%非轉(zhuǎn)移性患者CTC中呈現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)表達，而在轉(zhuǎn)移性患者中僅有15%呈現(xiàn)EGFR表達。在接受原發(fā)手術(shù)患者中CTC的CEA表達較低(15%)，而轉(zhuǎn)移性患者CTC中80%呈現(xiàn)CEA表達，指出CTC分子譜可作為個體化治療中鑒別治療靶，如HER-2或EGFR。

5 結(jié)語

CTC檢測可用于多種實體惡性腫瘤的無創(chuàng)診斷，能夠反映惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、復(fù)發(fā)，預(yù)測腫瘤患者預(yù)后，評價腫瘤患者療效，輔助制定個體化治療方案，鑒定抗腫瘤藥物的臨床價值。隨著標準化、有效富集和鑒定實體瘤外周血CTC方法的建立，CTC轉(zhuǎn)移的分子機制進一步闡明，大樣本多中心的CTC臨床試驗驗證，CTC可為實體瘤的診療提供新的工具。