Fmoc-苯丙氨酸水凝膠及其復(fù)配EGCG抑菌作用研究

付成，袁發(fā)滸，胡蕓瑕，高連君，魏棟玉，陳春蘭

（1.江漢大學(xué)交叉學(xué)科研究院，湖北 武漢 430056；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

隨著人們生活品質(zhì)的提升，食品安全問(wèn)題已成為現(xiàn)今社會(huì)的熱點(diǎn)議題，其中食品微生物危害是食品衛(wèi)生中的重要部分，而隨著食品種類(lèi)、樣式的不斷豐富和發(fā)展，尤其是各式各樣零食及冷飲食品的出現(xiàn)[1]，使得相關(guān)產(chǎn)品對(duì)抑菌的要求也越來(lái)越高。目前，在食品安全方面的抑菌材料也非常多，比如苯甲酸鹽類(lèi)、山梨酸鹽類(lèi)、對(duì)羥基苯甲酸等有機(jī)化學(xué)防腐劑，此類(lèi)防腐劑雖然效果不錯(cuò)，但是目前食品安全發(fā)展的趨勢(shì)之一就是向著天然產(chǎn)物的方向發(fā)展[2]，比如具有抑菌效果的多肽、多糖等。多肽在食品安全方面已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用，目前食品安全方面研發(fā)的多肽材料中，抑菌肽是一類(lèi)重要的小分子[3-4]。與抗生素相比，抑菌肽具有高效、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)[3]。抑菌肽根據(jù)來(lái)源、分子結(jié)構(gòu)或者應(yīng)用對(duì)象的不同，可以分為很多類(lèi)，其中抑菌肽形成的水凝膠就是一種具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)能力的自組裝結(jié)構(gòu)[5-7]。宋濤等[8]合成一種分子結(jié)構(gòu)為兩親嵌段的共聚物，即聚己內(nèi)酯-聚谷氨酸，它可以形成囊泡。在囊泡上面沉積納米銀，再把抑菌囊泡與普朗尼克F127 混合形成水凝膠，而形成的水凝膠則用于抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。除了共聚物外，石璐[9]利用半胱氨酸和銀納米簇絡(luò)合作用形成的水凝膠殺滅砧板上雜菌，殺滅數(shù)值為1.25，滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)中殺滅對(duì)數(shù)值1.0 的要求。

芴甲氧羰基-苯丙氨酸（N-[（9H-fluoren-9-ylmethoxy）carbonyl]-3-phenylalanine，F(xiàn)moc-Phe）是一種氨基酸衍生物的超分子水凝膠因子，研究顯示在弱堿性緩沖液中可以形成水凝膠，并與石墨烯[10]、碳納米管[11]、原位合成納米銀[12]形成雜化水凝膠材料，也可以包覆水楊酸用于抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[13]，包覆并控制釋放丁香精油[14]。相較聚合水凝膠而言，它具有小分子容易滲透的優(yōu)勢(shì)，而且該分子來(lái)源簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，生物相容性很好。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是一種目前廣泛研究的天然抗氧化劑[15]，它具有很強(qiáng)的抗氧化性，還具有抗炎、抗病毒等方面的作用[16-17]。在食品工業(yè)領(lǐng)域，EGCG 被廣泛應(yīng)用于食品保鮮、防腐等方面的基礎(chǔ)研究及實(shí)際生產(chǎn)，表明EGCG 是一種可應(yīng)用于食品領(lǐng)域的天然的新型廣譜抑菌成分[18-21]。

為了研究構(gòu)型對(duì)抑菌性的影響，本文利用具有對(duì)映異構(gòu)體的D 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-DPhe）和L 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-LPhe）作為凝膠因子，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液制備水凝膠并用于測(cè)試其對(duì)抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的效果，并初步探討二者的抑菌性性能差異及抑菌機(jī)理。此外，為了提高水凝膠的抑菌效果，本文將EGCG 復(fù)配到Fmoc-苯丙氨酸制備的水凝膠中，研究含有EGCG 的超分子水凝膠的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fmoc-苯丙氨酸（L/D 型）、苯丙氨酸（L/D 型）、Fmoc-甘氨酸（L 型）、Fmoc-酪氨酸（L 型）：上海吉爾生化有限公司；磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)；EGCG：杭州普麗美地生物科技有限公司；細(xì)菌培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（HH420）：金壇市科析儀器有限公司；旋渦混勻器（Vortex3）：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；電子分析天平（ME414S）：德國(guó) Sartorius；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（LAMBDA 25）、分子熒光光譜儀（LS55）：美國(guó) PerkinElmer；圓二色譜儀（J1500）：日本 JASCO；高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（HITACHI SU8000）：日本HITACHI。

1.3 方法

1.3.1 Fmoc-Phe 水凝膠的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取12 mg 的Fmoc-Phe，加入1 mL pH 7.4的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，旋渦振蕩5 min，80 ℃水浴加熱15 min，冷卻后即可形成澄清透明的凝膠。

1.3.2 紫外可見(jiàn)吸收光譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含F(xiàn)moc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的溶液加入到石英比色皿中。LAMBDA 25 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描200 nm～700 nm 波長(zhǎng)的吸收曲線(xiàn)。

1.3.3 熒光光譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含F(xiàn)moc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的熱溶液加入到石英比色皿中，冷卻形成水凝膠。穩(wěn)態(tài)熒光光譜在LS55 型熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行，激發(fā)光波長(zhǎng)265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)325 nm，狹縫寬度5。

1.3.4 圓二色譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含F(xiàn)moc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的熱溶液加入到石英比色皿中，冷卻形成水凝膠。采用J1500 型圓二色譜儀（CD）測(cè)試250 nm～400 nm 的CD信號(hào)。

1.3.5 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察

將凝膠樣品的熱溶液滴加少許于先劃好的直徑低于5 mm 的玻璃片，待凝膠形成后，將玻璃片在液氮中冷凍10 min，將凍干的玻璃片放入冷凍干燥機(jī)中凍干。凍干的玻璃片放入日立高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡中測(cè)試其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.6 抑菌性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，制備細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（1.5%），挑取金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CGMCC1.282），密集劃線(xiàn)法或涂布法接種于瓊脂平板，而后取內(nèi)徑6 mm 的無(wú)菌打孔器，對(duì)稱(chēng)的在瓊脂上，挖取加樣孔，分別注入未冷卻（約55 ℃）Fmoc-氨基酸凝膠液或100 μL 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。待凝膠形成后，將檢測(cè)平板置于電熱培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 而后量取抑菌圈直徑。

為進(jìn)一步探討Fmoc-Phe 水凝膠與EGCG 復(fù)配的抑菌效果，將Fmoc-DPhe 充分溶解，溶解之后加入EGCG 溶液，確保EGCG 的最終濃度在5 mg/mL。制備金黃色葡萄球菌懸液，并以10 倍梯度稀釋選擇合適的菌液濃度用于抑菌試驗(yàn)。將制備好Fmoc-DPhe 凝膠、含EGCG 的Fmoc-DPhe 凝膠及EGCG 溶液分別置于菌懸液中作用一段時(shí)間，吸取0.5 mL 上述混合均勻的菌懸液接種于無(wú)菌平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水凝膠物理化學(xué)表征

Fmoc-Phe 是一種高效的凝膠因子，具有很強(qiáng)的自組裝能力，它通過(guò)苯環(huán)間π-π 堆積、范德華力等非共價(jià)相互作用自組裝形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚集體，是一種常見(jiàn)的用于多肽合成的氨基酸衍生物，它具有L型（Fmoc-LPhe）和D型（Fmoc-DPhe）兩種鏡像對(duì)映異構(gòu)體。為了研究對(duì)映異構(gòu)體分子對(duì)抑菌效果的影響，分別制備了兩種構(gòu)象的超分子水凝膠，通過(guò)紫外可見(jiàn)光吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜等進(jìn)行化學(xué)表征。

紫外-可見(jiàn)光吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的紫外吸收光譜曲線(xiàn)Fig1 The absorption spectrum curve of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

紫外-可見(jiàn)光吸收曲線(xiàn)（圖1）顯示，F(xiàn)moc-DPhe 和Fmoc-LPhe 在200 nm～300 nm 區(qū)域有紫外吸收，但是二者的吸收曲線(xiàn)沒(méi)有明顯的區(qū)別。

分子熒光光譜圖見(jiàn)圖2。

分子熒光光譜（圖2）結(jié)果顯示，在265 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)下，F(xiàn)moc-DPhe 和Fmoc-LPhe 水凝膠均在325 nm處有最強(qiáng)的熒光信號(hào)。

圓二色光譜圖見(jiàn)圖3。

圓二色光譜圖信號(hào)顯示（圖3），兩種對(duì)映異構(gòu)體形成的水凝膠，其信號(hào)的強(qiáng)度一致，但是方向是相反的，因此該水凝膠是具有對(duì)映異構(gòu)體的鏡像對(duì)稱(chēng)性質(zhì)。

圖2 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的熒光光譜曲線(xiàn)。Fig.2 The fluorescence spectra of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

圖3 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的圓二色光譜圖Fig.3 The circular dichromatic spectrum of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 自組裝形成的水凝膠外觀上都是澄清透明。場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡的微觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖像Fig.4 Field emission scanning electron microscopy images of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel，respectively

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡的微觀結(jié)構(gòu)（圖4A 和圖4B）顯示，雖然兩種水凝膠的CD 信號(hào)方向?qū)ΨQ(chēng)相反，但是超分子水凝膠自組裝結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯的區(qū)別。

2.2 Fmoc-Phe水凝膠抑菌效果觀察

水凝膠抑菌效果見(jiàn)圖5。

如圖5所示，濃度為12 mg/mL 的兩種不同構(gòu)象的Fmoc-Phe 水凝膠均對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用，且D 型的Fmoc-Phe 水凝膠抑菌性要強(qiáng)于L 型（P＜0.01）。

圖5 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抑作用Fig.5 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

2.3 Fmoc-DPhe與EGCG復(fù)配水凝膠抑菌效果研究

EGCG 是近年來(lái)廣泛研究的植物活性成分，因其較好的抗氧化、抑菌性能，被認(rèn)為是一種可應(yīng)用于食品領(lǐng)域的新型抑菌劑。本研究探討了Fmoc-DPhe 水凝膠與EGCG 復(fù)配的抑菌性能。12 mg/mL 的Fmoc-DPhe與5 mg/mL 的EGCG 復(fù)配的水凝膠抑菌能力顯著高于單獨(dú)使用其中一種（見(jiàn)圖6）。

圖6 Fmoc-DPhe水凝膠與EGCG復(fù)配對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe hydrogel in combination with EGCG

2.4 Fmoc-氨基酸水凝膠抑菌機(jī)理初探

為探究Fmoc-氨基酸水凝膠抑菌機(jī)理，本研究分別測(cè)試了光學(xué)構(gòu)象以及Fmoc 基團(tuán)對(duì)抑菌作用的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 Fmoc基團(tuán)及光學(xué)構(gòu)象Fmoc-氨基酸凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用的影響Fig.7 Effect of Fmoc group and optical conformation to Fmocamino acid gel on inhibition of Staphylococcus Aureus

發(fā)現(xiàn)在濃度、pH 值一致時(shí)，無(wú)光學(xué)異構(gòu)特征的Fmoc-甘氨酸比兩種構(gòu)型的Fmoc-苯丙氨酸的抑菌性能弱的很多。同時(shí)，將兩種不同光學(xué)構(gòu)型的苯丙氨酸分子與其對(duì)應(yīng)的Fmoc-苯丙氨酸分子對(duì)比，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸對(duì)映異構(gòu)體對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有抑制作用。

進(jìn)一步的，為驗(yàn)證氨基酸中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)是否與Fmoc 基團(tuán)協(xié)同作用從而產(chǎn)生抑菌性能，將Fmoc-LTyr與Fmoc-DPhe 形成的凝膠作對(duì)比，可見(jiàn)兩種含苯環(huán)的氨基酸經(jīng)Fmoc 修飾后均可表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制做用（見(jiàn)圖8）。

圖8 Fmoc-DPhe凝膠與Fmoc-LTyr凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用對(duì)比Fig.8 The inhibition effect of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LTyr gel on Staphylococcus Aureus was compared

3 結(jié)論

系統(tǒng)對(duì)比了經(jīng)Fmoc 基團(tuán)修飾后不同光學(xué)構(gòu)象的苯丙氨酸制備的超分子水凝膠的物理特征，發(fā)現(xiàn)除光學(xué)構(gòu)象不同外，其他物理性質(zhì)基本無(wú)差異。進(jìn)一步對(duì)兩種構(gòu)象的Fmoc-Phe 的抑菌作用對(duì)比發(fā)現(xiàn)，非天然的D 型Fmoc-Phe 抑菌作用優(yōu)于L 型Fmoc-Phe。

通過(guò)將天然抑菌分子EGCG 與Fmoc-Phe 凝膠復(fù)配，可以發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同增效抑菌。這為Fmoc-Phe在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。同時(shí)，本研究還進(jìn)一步的對(duì)Fmoc 基團(tuán)修飾氨基酸產(chǎn)生的抑菌作用機(jī)制做了探討，發(fā)現(xiàn)Fmoc 修飾的氨基酸的抑菌能力是由苯環(huán)母體經(jīng)Fmoc 基團(tuán)修飾后產(chǎn)生的，這為后續(xù)其他Fmoc 氨基酸水凝膠的開(kāi)發(fā)提供了方向。