白光衍射相位成像應(yīng)用于生物活細(xì)胞定量相位成像的研究*

張佳恒, 馬利紅, 應(yīng)朝福

(浙江師范大學(xué) 信息光學(xué)研究所,浙江 金華 321004)

0 引 言

由于生物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和大部分細(xì)胞器的光學(xué)吸收系數(shù)很小，幾乎無(wú)色透明，因此,傳統(tǒng)明場(chǎng)顯微圖像通常對(duì)比度很低，很難觀察到有用的細(xì)胞細(xì)節(jié).生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征及各組分不同的折射率分布對(duì)于入射光波最直接的影響就是產(chǎn)生不同的相位延遲，即相移.澤尼克相襯顯微[1]與微分干涉相襯顯微技術(shù)[2]作為最常用的相位成像方法，可將相移差異轉(zhuǎn)換為圖像的強(qiáng)度對(duì)比，大大提高了細(xì)胞等弱吸收樣品的圖像襯度.但是這2種方法只是將相移分布定性地轉(zhuǎn)化成了圖像的強(qiáng)度分布，不能用于細(xì)胞的定量測(cè)量.隨著生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，生物學(xué)家們也越來(lái)越意識(shí)到定量測(cè)量細(xì)胞和組織中的相位分布特性對(duì)于細(xì)胞顯微觀察、結(jié)構(gòu)信息提取及動(dòng)力學(xué)行為研究的重要性.因此，定量相位顯微技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展已成為必然趨勢(shì).

白光衍射定量相位顯微術(shù)[3-5]是一種基于白光干涉的定量相位成像技術(shù)，可以精確地獲取樣品的高分辨率相位信息.該技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：從光源上看，采用白光作為照明光源，其相干長(zhǎng)度非常短，小于1 μm，因此,可以避免由光源強(qiáng)相干性產(chǎn)生的相干噪聲及寄生條紋噪聲[6-7]；從結(jié)構(gòu)上看，采用共路結(jié)構(gòu)，由于其物光和參考光共路的特性，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[8-10]；從記錄方式上看，利用光柵衍射與4f系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)離軸記錄，具有離軸干涉成像的優(yōu)勢(shì)，可以從單張干涉圖獲取物體相位信息，實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程.因此，白光衍射定量相位顯微術(shù)已得到廣泛的研究與關(guān)注.

為了實(shí)現(xiàn)生物活體細(xì)胞的高分辨率定量相位成像，筆者設(shè)計(jì)并組建了一套倒置式白光衍射顯微相位成像系統(tǒng).系統(tǒng)的空間成像噪聲低于0.60 nm，時(shí)間成像噪聲低于0.04 nm.首先用標(biāo)準(zhǔn)樣品驗(yàn)證了系統(tǒng)測(cè)量的準(zhǔn)確性；然后以活體血紅細(xì)胞與大腸桿菌細(xì)胞為樣品，獲得了準(zhǔn)確的定量相位像；最后對(duì)霉菌孢子進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的成像記錄，獲得了其在水中萌發(fā)的動(dòng)態(tài)定量相位像.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)成像精度高，且具有長(zhǎng)時(shí)間觀察生物活細(xì)胞的能力.

1 白光衍射顯微相位成像基本原理

圖1 白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)光路原理圖

組建的白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)的光路原理如圖1所示，它是在倒置式明場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上附加了一個(gè)4f結(jié)構(gòu)光學(xué)模塊.系統(tǒng)照明光源是鹵素?zé)舭坠夤庠?，采用科勒照明光路，并將顯微鏡照明數(shù)值孔徑設(shè)置到最小，以獲得部分空間相干光，使之滿(mǎn)足干涉條件.被測(cè)樣品被近似平面光波場(chǎng)照明，并通過(guò)顯微物鏡顯微放大成像.在它的像平面放置一塊黑白光柵以產(chǎn)生多級(jí)衍射光，每一級(jí)光均包含了物體的全部空間信息.通過(guò)透鏡L1對(duì)衍射光波場(chǎng)進(jìn)行傅里葉變換，在透鏡的焦平面可以得到各級(jí)頻譜分布.在該頻譜面放置一個(gè)如圖1所示的濾波器，其中針孔濾波器對(duì)0級(jí)光進(jìn)行低通濾波，使直流信息通過(guò)，作為參考光波場(chǎng)；+1級(jí)濾波器讓+1級(jí)光全部通過(guò)，從而得到完整的物光場(chǎng)信息.最后通過(guò)透鏡L2進(jìn)行逆傅里葉變換，在CCD像平面，物光場(chǎng)和參考光場(chǎng)干涉形成離軸干涉圖.透鏡L1和透鏡L2形成一個(gè)4f結(jié)構(gòu)的馬赫-曾德干涉儀.

被測(cè)樣品的頻帶受顯微物鏡衍射限制，在CCD 平面其最高頻率β為

(1)

式(1)中：k0=2π/λ0；λ0表示中心波長(zhǎng)，574 nm；NAobj表示顯微物鏡數(shù)值孔徑；Mobj表示顯微物鏡放大倍數(shù)；M4f表示4f結(jié)構(gòu)橫向放大倍數(shù).基于離軸干涉圖的三項(xiàng)分離原則，光柵調(diào)制得到的參考光載頻至少為樣品最高頻率的3倍才能避免混頻.這樣，在CCD平面上，干涉信號(hào)的最高頻率至少為4β.同時(shí)為了滿(mǎn)足Nyquist采樣定理，CCD像素采樣頻率必須大于等于8β.系統(tǒng)中各光學(xué)元件的選擇要求如參考文獻(xiàn)[11].本系統(tǒng)采用的顯微物鏡為40x/0.75，因此,系統(tǒng)的橫向分辨率達(dá)到0.765 μm；光柵常數(shù)為7.500 μm；4f結(jié)構(gòu)橫向放大倍率M4f= 3.0；CCD相機(jī)像元間距a=3.45 μm×3.45 μm，像素?cái)?shù)為2 248×2 048，可根據(jù)需要選擇成像區(qū)域的大小.

在CCD記錄面，假設(shè)物光波為Uo，參考光波為Ur，則可以得到干涉場(chǎng)的強(qiáng)度分布為

I(x,y)= |Uo(x,y)+Ur(x,y)|2=

(2)

對(duì)記錄的干涉圖作傅里葉變換，得到0級(jí)、±1級(jí)分離的頻譜圖，通過(guò)濾波操作，濾除0級(jí)和-1級(jí)頻譜，并將+1級(jí)移至中心，再作逆傅里葉變換，由于記錄的是像面干涉圖，直接得到物光波的復(fù)數(shù)場(chǎng)U(x,y).由該復(fù)數(shù)場(chǎng)得到相位分布：

(3)

式(3)中：Re表示取復(fù)振幅的實(shí)部;Im表示取虛部.但是，由反正切計(jì)算得到的相位值分布區(qū)間([-π,π] )是包裹相位值.因此，一般情況下，要得到物體的真實(shí)相位分布還通常需要利用二維解包裹算法得到展開(kāi)的相位分布.本文采用基于離散余弦變換(DCT)的最小二乘相位解包裹算法[12],并為了消除由參考光波、顯微物鏡成像、系統(tǒng)像差及各種背景噪聲引起的附加相位因子，采用減去參考平面相位的方法進(jìn)行相位補(bǔ)償[13].

2 系統(tǒng)成像準(zhǔn)確度和噪聲測(cè)量

首先測(cè)量了系統(tǒng)的相位成像準(zhǔn)確性，選用標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯微球作為被測(cè)樣品進(jìn)行成像測(cè)量.微球直徑為(2±5%) μm，折射率為1.59.取少量微球散落于載波片，滴入顯微物鏡浸油(折射率為1.518)浸沒(méi)微球，并蓋上蓋波片.將此標(biāo)準(zhǔn)樣品放入載物臺(tái)，進(jìn)行調(diào)焦，使之成像于CCD相機(jī)平面.記錄的干涉圖如圖2(a)所示，圖2(b)是2(a)矩形框所選部分的放大圖，圖2(c)是干涉圖2(a)的頻譜圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對(duì)樣品干涉圖和參考干涉圖分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到展開(kāi)相位分布，并進(jìn)行相位相減，得到相位像，如圖2(d)所示.利用已知的微球折射率和浸油折射率，由測(cè)量的相位分布可以計(jì)算得到微球形貌，如圖2(e)所示.圖2(f)是沿圖2(d)中所畫(huà)過(guò)微球中心直線(xiàn)的微球厚度分布截線(xiàn)圖，證實(shí)了組建的白光衍射顯微相位成像系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的定量相位成像性能.

圖2 標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯微球?qū)嶒?yàn)結(jié)果

同時(shí)測(cè)量了系統(tǒng)的時(shí)空噪聲.時(shí)空噪聲是測(cè)量系統(tǒng)的一個(gè)重要參數(shù)，直接影響系統(tǒng)的測(cè)量敏感度，即決定系統(tǒng)能夠測(cè)量的最小光程變化.在移除樣品的情況下，以20 幀/s的速度記錄了257 張干涉圖，像素?cái)?shù)為1 024×1 024.將第1幀干涉圖作為參考干涉圖，對(duì)所有的干涉圖作數(shù)據(jù)處理，得到256 張相位圖.利用相位和光程的關(guān)系，繼而得到256張光程分布圖.對(duì)任一張光程分布圖求均方差，得到空間噪聲均低于0.60 nm.對(duì)所有256張光程分布圖作時(shí)間堆積，然后做空間均方差，得到時(shí)間噪聲，時(shí)間噪聲小于0.04 nm.因此，該系統(tǒng)具有很高的時(shí)空敏感度.

3 活體生物細(xì)胞相位成像

3.1 血紅細(xì)胞相位成像

圖3 血紅細(xì)胞相位成像

血紅細(xì)胞作為血液中個(gè)數(shù)最多的血細(xì)胞，具有運(yùn)輸氧氣與二氧化碳的功能.血紅細(xì)胞形態(tài)和動(dòng)態(tài)特性的研究和檢測(cè)，對(duì)臨床診斷和病理研究具有重要意義.正常成熟的人血紅細(xì)胞(直徑只有6～8 μm)是“甜甜圈”型，中間下凹，邊緣較厚，并且沒(méi)有細(xì)胞核等細(xì)胞器，富含血紅蛋白.從實(shí)驗(yàn)室健康成年男性指尖取少許血液，滴入質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水中，保證血紅細(xì)胞的活性和正常生理活動(dòng).用移液管取1 μL的溶液，滴到載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品.將樣品放到載物臺(tái)上，并待血紅細(xì)胞粘滯到載玻片上后，對(duì)血紅細(xì)胞聚焦成像.圖3(a)為記錄的干涉圖，圖3(b)是3(a)矩形框所選部分的放大圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對(duì)樣品干涉圖和參考干涉圖分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到展開(kāi)相位分布，并進(jìn)行相位相減，得到相位像，如圖3(c)所示.圖3(d)是3(c)矩形框中單個(gè)血紅細(xì)胞相位分布的三維圖.圖3(e)是沿著圖3(c)中過(guò)血紅細(xì)胞中心的直線(xiàn)所示的血紅細(xì)胞相位分布曲線(xiàn).

3.2 大腸桿菌相位成像

大腸桿菌是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，其結(jié)構(gòu)成桿狀，分裂方式為二分分裂.取微量大腸桿菌擴(kuò)散在水中，用移液管取1 μL的溶液，滴在載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品.圖 4(a)為大腸桿菌干涉圖，圖4(b)是4(a)矩形框所選部分的放大圖.移除樣品，記錄參考干涉圖.對(duì)樣品干涉圖和參考干涉圖分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到展開(kāi)相位分布，并進(jìn)行相位相減，得到相位像，如圖4(c) 所示.圖 4(d)是4(c)矩形框 1 中單個(gè)大腸桿菌的相位分布放大圖，該大腸桿菌未開(kāi)始分裂.圖4(e)是4(c)矩形框 2 中單個(gè)大腸桿菌的相位分布放大圖，該大腸桿菌已明顯地處于二分裂狀態(tài).

圖4 大腸桿菌相位成像

3.3 生物細(xì)胞時(shí)間序列相位成像

霉菌繁殖迅速，常造成食品及用具的大量霉腐變質(zhì)，但也有許多有益種類(lèi)，如紅曲霉便是有益種類(lèi)中的一種.紅曲霉能產(chǎn)生大量的天然紅色素，并能產(chǎn)生有益降膽固醇、降血壓等物質(zhì)，因而已受到研究者的廣泛關(guān)注.紅曲霉孢子呈球形或橢圓形，大小為(6.5～10.5) μm× (7.0～9.0) μm.取微量紅曲霉孢子擴(kuò)散在水中，用移液管取1 μL的溶液，滴在載玻片上，并蓋上蓋玻片，制作成樣品，在室溫(25 ℃左右)下長(zhǎng)時(shí)間觀察.首先在不放置樣品時(shí)，記錄一張干涉圖，作為參考干涉圖.然后放入樣品，每間隔5 min記錄一張干涉圖，連續(xù)記錄24 h.圖5是某孢子開(kāi)始萌發(fā)后每隔15 min的重建相位像序列，可以看到孢子的萌發(fā)過(guò)程，正在形成孢子管.證明了該系統(tǒng)具有連續(xù)穩(wěn)定的獲取生物細(xì)胞定量相位像的能力.

圖 5 孢子萌發(fā)的動(dòng)態(tài)相位像序列

4 結(jié) 論

構(gòu)建了基于白光衍射的定量顯微相位成像系統(tǒng)，并進(jìn)行了生物活體細(xì)胞的成像研究.結(jié)果表明，該系統(tǒng)可以很好地應(yīng)用于生物細(xì)胞的定量相位成像，尤其是該系統(tǒng)采用的白光照明，對(duì)生物細(xì)胞沒(méi)有任何的損傷，適用于長(zhǎng)期的生物活體細(xì)胞探測(cè).因此，該系統(tǒng)在生物細(xì)胞定量測(cè)量方面很有優(yōu)勢(shì)，為活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)研究提供了一種很有效的手段，期望為早期醫(yī)學(xué)診斷和藥物研發(fā)等提供一定的分析評(píng)價(jià)依據(jù).