外源乙烯對(duì)鎘處理下玉米幼苗生理代謝的影響*

劉 娟, 趙歡蕊, 劉永華, 王鏡惠

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外源乙烯對(duì)鎘處理下玉米幼苗生理代謝的影響*

劉 娟1, 趙歡蕊1, 劉永華1, 王鏡惠2

(1. 榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 榆林 719000; 2. 榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院 榆林 719000)

為探討外源乙烯緩解玉米()幼苗鎘(Cd)毒害的生理機(jī)制, 通過水培試驗(yàn)研究了Cd處理下, 外源乙烯對(duì)玉米幼苗相關(guān)生理指標(biāo)與Cd的亞細(xì)胞分布的影響, 以不做任何處理為空白對(duì)照, 以Cd處理和(NH4)2SO4處理為試驗(yàn)對(duì)照。結(jié)果顯示, 相對(duì)Cd處理, 乙烯和(NH4)2SO4處理可顯著降低Cd脅迫下玉米幼苗H2O2和丙二醛(MDA)含量, 使凈光合速率分別提升1.23倍和1.22倍; 顯著降低抗氧化物酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性, 抗氧化物質(zhì)[抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)]含量則顯著上升。另外, 相對(duì)于Cd處理, 乙烯+Cd處理可使玉米幼苗ATP硫酸化酶活性、谷胱甘肽還原酶(GR)活性、半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(GSH)含量分別上升54.43%、27.93%、50.77%和49.85%, 而對(duì)非蛋白硫醇(NPT)和植物螯合素(PCs)含量無顯著性影響。在乙烯+Cd處理的基礎(chǔ)上添加GSH合成抑制劑BSO(buthionine sulfoximine)可導(dǎo)致玉米葉片GSH含量顯著降低, H2O2含量上升, 光合速率下降。外源乙烯可顯著降低Cd脅迫下玉米葉片Cd含量, 而顯著提升根部細(xì)胞壁和液泡中Cd含量。因此, 外源乙烯一方面通過提升玉米葉片GSH和AsA含量, 增強(qiáng)葉片非酶促抗氧化能力, 而非通過抗氧化酶促反應(yīng)和NPT、PCs的螯合作用; 另一方面則通過根細(xì)胞壁的固定作用和液泡區(qū)室化作用, 減少Cd向玉米葉片中的轉(zhuǎn)移, 從而緩解Cd毒害。研究結(jié)果可為乙烯作為潛在的作物重金屬拮抗劑提供理論依據(jù)。

鎘; 乙烯; 玉米; 生理機(jī)制; 硫; 幼苗

鎘(cadmium, Cd)的生物半衰期長(zhǎng), 即使是低濃度Cd對(duì)人體也會(huì)造成潛在的威脅。我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤遭受Cd污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7%, Cd已成為我國(guó)土壤重金屬污染中的首要污染物[1]。Cd脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧(ROS)含量上升, 破壞葉綠體結(jié)構(gòu)、抑制碳固定酶活性, 并通過影響蛋白酶活性而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂等[2-3]。另外, Cd脅迫抑制營(yíng)養(yǎng)元素吸收而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受限[4], 還能通過食物鏈危害人體健康[5]。因此, 研究緩解或解除植物中Cd毒害的措施及其機(jī)理, 是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。

為應(yīng)對(duì)Cd脅迫環(huán)境, 植物會(huì)采取多種途徑增強(qiáng)自身對(duì)Cd的耐受性。細(xì)胞壁是植物抵御Cd脅迫的第一道屏障, 可以在Cd進(jìn)入細(xì)胞之前, 通過配合作用固定住部分Cd[6]。另外, 液泡的區(qū)室化作用也是重金屬解毒的重要措施[7]。Cd脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量ROS可以在抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等]和抗氧化物質(zhì)(抗壞血酸、谷胱甘肽等)的作用下加以清除。另一方面, 通過非蛋白硫醇(non-protein thiol)和植物螯合素的螯合作用, 可降低Cd的毒害效應(yīng)[8-9]。

乙烯是一種調(diào)控植物生長(zhǎng)的重要?dú)鈶B(tài)植物激素, 參與種子萌發(fā)、生長(zhǎng)、下胚軸頂鉤形成、器官衰老、果實(shí)成熟等過程, 同時(shí)也涉及多種逆境脅迫過程[10], 如干旱、高溫、低溫、高鹽、病害等脅迫下, 通過影響植物的碳代謝、糖代謝、激素代謝和蛋白質(zhì)代謝等多方面, 調(diào)節(jié)植物的光合作用與生長(zhǎng), 以應(yīng)對(duì)逆境脅迫[11-13]。添加外源乙烯可以增強(qiáng)Cd脅迫下芥菜()葉片的光合作用, 從而提升其Cd耐受能力[14]。對(duì)其中的機(jī)理也有較多報(bào)導(dǎo), 如研究發(fā)現(xiàn), 乙烯可以通過抑制擬南芥()葉片中Cd脅迫誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生[15], 增加主根長(zhǎng)度和分生根數(shù)量[16], 以增強(qiáng)擬南芥對(duì)Cd脅迫的耐受性。同時(shí), 外源乙烯可以通過增強(qiáng)植物體內(nèi)硫代謝物的合成, 以提升植物對(duì)Cd脅迫的耐受性[14]。雖然這些研究對(duì)明確乙烯調(diào)節(jié)植物響應(yīng)Cd脅迫的內(nèi)在機(jī)理具有一定作用, 但是不同作物的遺傳背景差異, 導(dǎo)致不同植物在響應(yīng)逆境脅迫中所采用的機(jī)制不同。因此, 本研究分析了外源乙烯對(duì)Cd脅迫下玉米()幼苗生理代謝的影響, 并揭示其內(nèi)在機(jī)制。

玉米是榆林地區(qū)的第二大糧食作物, 但由于該區(qū)多年煤礦資源的過度開采, 導(dǎo)致重金屬污染, 尤其是表層土壤受到Cd污染較嚴(yán)重[17]。當(dāng)前, 已有研究發(fā)現(xiàn), 添加外源物質(zhì)可促進(jìn)玉米在Cd污染環(huán)境中的生長(zhǎng), 如薛洪寶等[8]揭示了硫醇化合物在玉米發(fā)芽過程中與Cd的相互作用, 可緩解Cd對(duì)玉米的毒害; 王玉萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可以通過增強(qiáng)玉米光合速率和PSⅡ功能而促進(jìn)玉米在Cd脅迫環(huán)境中的生長(zhǎng)。

然而, 當(dāng)前對(duì)外源乙烯緩解Cd毒害的研究在玉米中尚少涉及。因此, 本研究以玉米為試材, 探討Cd脅迫下外源乙烯對(duì)玉米光合作用、氧化還原水平、內(nèi)源硫代謝物含量等生理代謝的影響, 以揭示外源乙烯緩解玉米Cd毒害的作用機(jī)理, 為提高重金屬污染環(huán)境中的作物產(chǎn)量和安全、改良土壤重金屬污染等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)玉米品種為春播玉米‘中榆968’。選取籽粒飽滿、大小均勻無蟲害的種子, 用0.1% HgCl2溶液消毒8 min后, 用蒸餾水漂洗干凈, 置于有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中催芽72 h, 發(fā)芽條件為溫度(25±1) ℃、相對(duì)濕度75%的生化培養(yǎng)箱。玉米出苗后, 選取長(zhǎng)勢(shì)一致健康植株移栽到裝有1/2 Hoagland(pH 6.0)營(yíng)養(yǎng)液的白色方盆(38 cm×31 cm×13cm)中, 于人工氣候室內(nèi)常規(guī)培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為: 光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h, 晝夜溫度為25 ℃/20 ℃, 光照強(qiáng)度為110 μmol?m-2?s-1, 相對(duì)濕度為70%。培養(yǎng)期間, 持續(xù)用真空抽氣泵向營(yíng)養(yǎng)液中泵氣, 每2 d更換營(yíng)養(yǎng)液, 并交換塑料盆的位置, 以保證光照均勻, 在4葉一心期, 選擇長(zhǎng)勢(shì)良好和長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)處理, 所有處理均同時(shí)進(jìn)行。

Cd2+供體為氯化鎘(CdCl2?2.5H2O, 國(guó)產(chǎn)分析純, 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司), 在上述培養(yǎng)條件下, 我們前期研究了不同濃度Cd和乙烯利(乙烯供體)處理對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響, 發(fā)現(xiàn)Cd脅迫可抑制玉米幼苗葉片和根的延伸, 并降低其生物量, 而添加外源乙烯可緩解Cd對(duì)玉米幼苗的抑制作用。為驗(yàn)證玉米Cd耐受能力的提升確實(shí)是通過外源乙烯的作用而獲得, 以乙烯活性抑制劑二環(huán)庚二烯(norbornadiene, NBD)處理玉米幼苗, 研究其對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響。為驗(yàn)證外源乙烯是通過增強(qiáng)玉米硫(sulphur, S)代謝以提升玉米的耐Cd能力, 以(NH4)2SO4處理作為樣品對(duì)照之一。通過前期試驗(yàn)篩選得到玉米Cd脅迫臨界濃度為100 mg?L-1, 外源乙烯、SO42-和NBD最佳濃度分別為200 μL?L-1、400 mg?L-1和100 μmol?L-1。因而, 本研究共設(shè)5個(gè)處理, 詳情見表1。因?yàn)镾O42-是以(NH4)2SO4的形式提供, 為排除NH4+的影響, 所有處理(包括對(duì)照)中除已經(jīng)添加(NH4)2SO4的處理組, 均添加800 mg?L-1的NH4Cl, 以維持NH4+濃度的一致。

另外, 為驗(yàn)證外源乙烯是通過增強(qiáng)玉米幼苗谷胱甘肽(GSH)的生物合成而起到緩解Cd毒害的作用, 在T1、T2和T4處理中添加0.5 mmol?L-1的GSH合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺(buthionine sulphoximine, BSO)。培養(yǎng)條件與上述一致。

每個(gè)處理8盆, 每盆種植玉米幼苗15株。脅迫處理10 d后取樣。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 H2O2與丙二醛(MDA)

H2O2含量的測(cè)定參考Okuda等[19]的方法進(jìn)行。MDA含量測(cè)定參考張志良等[20]的方法, 略微改動(dòng): 取玉米根或葉片組織0.5 g, 加入10 mL 0.5%(/)三氯乙酸進(jìn)行充分研磨, 將研磨液倒入10 mL離心管于3 000×g離心10 min。取上清液2 mL與2 mL 0.67%(/)的硫代巴比妥酸(TBA)充分混勻?；旌弦河?00 ℃水浴鍋中反應(yīng), 30 min后, 放于冰上迅速冷卻, 然后3 000×g離心10 min。上清液在450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)吸光值。根據(jù)張志良等[20]的計(jì)算公式, 計(jì)算樣品中MDA含量。

1.2.2 光合作用參數(shù)

選取充分伸展的玉米最上端葉片, 利用LI-6400XT便攜式光合測(cè)定儀測(cè)定光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度, 選用紅藍(lán)光源, 光強(qiáng)為1 000 μmol?m-2?s-1。葉室溫度25 ℃左右, 每次測(cè)定于10:00—14:00進(jìn)行。

1.2.3 相關(guān)酶活性

Rubisco酶活性測(cè)定參考Per等[21]的方法進(jìn)行。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性參照Zhou等[22]的方法測(cè)定, 過氧化氫酶(catalase, CAT)活性參照Aebi[23]的方法測(cè)定, 谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活性參照Foyer等[24]的方法測(cè)定。ATP硫酸化酶(ATP-S)活性參照Khan等[14]的方法測(cè)定。

1.2.4 抗氧化物質(zhì)和硫代謝物含量

抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)含量參考張志良等[20]的方法測(cè)定, 還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量參考Anderson[25]的方法測(cè)定, 半胱氨酸(cysteine, Cys)含量參考Gaitonde[26]的方法測(cè)定, 非蛋白硫醇(non-protein thiol, NPT)與植物螯合素(phytochelatins, PCs)含量參照Devi等[27]的方法測(cè)定。

1.2.5 Cd在植物組織的含量和亞細(xì)胞分布

在處理后10 d, 隨機(jī)選取對(duì)照(CK)、Cd處理(T1)與Cd+乙烯處理(T2)的玉米幼苗3株, 先用自來水快速?zèng)_洗掉葉片和根部附著物, 再用去離子水沖洗3次, 用吸水紙吸干表面水珠, 剪開苗的根系和地上部分, 分別于天平上稱鮮重, 然后于110 ℃干燥箱中進(jìn)行殺青1 h, 60 ℃恒溫干燥至恒重, 稱干重。干樣用HNO3-HClO4(4∶1/)消煮(160 ℃)至澄清, 定容以后, 利用原子吸收分光光度計(jì)(Thermo Scientific?, iCE 3300 AAS)測(cè)定各組織中的Cd含量。

利用差速離心法分離不同的亞細(xì)胞組分: 稱取0.2 g玉米葉片和根于預(yù)冷的研缽中, 加入10 mL預(yù)冷的提取緩沖液[250 mmol?L-1蔗糖, 50 mmol?L-1Tris-HCl (pH 7.5)和10 mmol?L-1的二硫蘇糖醇], 研磨至勻漿。將勻漿液在300×g下離心10 min, 沉淀即為細(xì)胞壁組分(F1組分); 將上清液在2 000×g下離心15 min, 沉淀為細(xì)胞核與葉綠體部分(F2組分); 上清液在10 000×g下離心20 min, 沉淀為線粒體部分(F3組分); 上清液則為含有液泡的可溶性組分(F4組分)。F2與F3組分合為細(xì)胞器組分。提取出的各組分進(jìn)行微波消解, 利用原子吸收法測(cè)定Cd的含量, 消解液組成為5 mL HNO3、1 mL H2O2, 消解后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Cd的含量, 其中F4組分直接上機(jī)測(cè)定[28-29]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3)表示。采用SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 各處理間數(shù)據(jù)采用方差分析(ANOVA), 顯著性差異水平為<0.05, 采用Microsoft excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源乙烯和(NH4)2SO4對(duì)Cd脅迫下玉米幼苗氧化脅迫和光合作用的影響

與對(duì)照(CK)相比, 100 mg?L-1Cd處理(T1)10 d后的玉米葉片H2O2和MDA含量顯著上升, 分別提升了2.24倍與2.37倍。Cd脅迫下添加外源乙烯(T2)和(NH4)2SO4(T3)以后, 均可使H2O2和MDA含量與僅Cd處理(T1)相比顯著降低。同時(shí)添加外源乙烯和(NH4)2SO4(T4), 可使H2O2和MDA含量進(jìn)一步降低, 而在NBD(T5)的作用下, H2O2和MDA含量相對(duì)T4顯著上升(表2)。結(jié)果表明, 外源乙烯和(NH4)2SO4可通過降低膜脂質(zhì)過氧化程度, 緩解Cd處理對(duì)玉米幼苗葉片的毒害, 且兩種外源物質(zhì)對(duì)緩解玉米Cd毒害具有協(xié)同效應(yīng)。

與T1相比, Cd脅迫下添加外源乙烯或(NH4)2SO4均可顯著提升玉米葉片氣孔導(dǎo)度和凈光合速率, 同時(shí)添加外源乙烯和(NH4)2SO4(T4), 氣孔導(dǎo)度和凈光合速率得到進(jìn)一步提升, 分別為T1處理的1.81倍和3.50倍, 而胞間二氧化碳濃度的變化趨勢(shì)與氣孔導(dǎo)度和凈光合速率的變化趨勢(shì)相反(表2)。而添加NBD處理(T5), 與T4相比, 則可顯著降低玉米幼苗葉片氣孔導(dǎo)度和凈光合速率, 胞間二氧化碳濃度則呈相反的變化趨勢(shì)(表2)。

玉米幼苗葉片中Rubisco酶活性在Cd處理(T1)后, 與對(duì)照(CK)相比下降57.26%。而再添加外源乙烯(T2)或(NH4)2SO4(T3)后, Rubisco酶活性相對(duì)T1, 分別提升了34.76%、38.98%, 同時(shí)添加乙烯和(NH4)2SO4(T4)則可使Rubisco酶活性與T1相比提升107.84%(表2)。另外, 添加NBD后(T5), Rubisco酶活性與T4相比下降10.82%(表2)。結(jié)果表明, Cd處理下玉米幼苗Rubisco酶活性降低, 影響光合作用的正常進(jìn)行, 外源乙烯和(NH4)2SO4處理能不同程度地提升Rubisco酶活性, 并一定程度上恢復(fù)玉米幼苗的光合作用(表2)。

表2 外源乙烯和(NH4)2SO4對(duì)Cd脅迫下玉米幼苗氧化脅迫和光合作用的影響

同行不同小寫字母表示各處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

2.2 外源乙烯和(NH4)2SO4對(duì)Cd脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響

與對(duì)照相比, Cd處理(T1)可顯著提升玉米幼苗葉片中的抗氧化酶(SOD、CAT)活性。而外源乙烯或(NH4)2SO4處理以后, 相對(duì)Cd處理, SOD活性下降至近乎對(duì)照水平, 而CAT活性雖然也呈降低趨勢(shì), 但仍顯著高于對(duì)照。同時(shí)添加外源乙烯和(NH4)2SO4(T4), SOD和CAT活性與對(duì)照相比已無顯著差異(表3)。

Cd處理(T1)下玉米幼苗中AsA含量與對(duì)照相比上升但無顯著差異, GSH含量則顯著上升; 在外源乙烯(T2)或(NH4)2SO4處理(T3)以后, 與單獨(dú)Cd處理(T1)相比AsA與GSH含量均顯著上升; 同時(shí)添加外源乙烯和(NH4)2SO4(T4), AsA和GSH含量達(dá)到最大值(表3)。GSH合成關(guān)鍵酶GR的活性與GSH含量的變化趨勢(shì)一致(表3)。而在添加NBD以后, 乙烯活性受到抑制, GR活性、GSH和AsA含量與T4比較顯著下降, CAT活性則顯著上升(表3)。結(jié)果表明, 抗氧化酶(SOD、CAT)在僅僅Cd處理(T1)下的玉米幼苗中發(fā)揮主要的抗氧化作用, 而AsA和GSH則在外源乙烯或(NH4)2SO4介導(dǎo)的Cd耐受過程中發(fā)揮重要作用。

表3 外源乙烯和(NH4)2SO4對(duì)Cd處理下玉米幼苗抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響

同行不同小寫字母表示各處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

2.3 外源乙烯和(NH4)2SO4對(duì)Cd脅迫下玉米幼苗硫代謝的影響

玉米幼苗葉片中ATP-S活性、Cys含量在Cd處理(T1)后較對(duì)照分別上升38.93%、102.97%, 而在添加外源乙烯(T2)或(NH4)2SO4(T3)以后, 兩者的含量進(jìn)一步上升, 相對(duì)Cd脅迫(T1)T2處理分別增加54.43%和50.77%, T3處理分別增加54.15%和46.11%, 同時(shí)添加外源乙烯和(NH4)2SO4, ATP-S活性與Cys含量相對(duì)Cd處理(T1)分別提升71.06%和114.34%; NBD處理(T5)可顯著降低ATP-S活性、Cys含量, 并使之降至T2水平(表4)。然而, NPT與PCs含量在各處理的葉片中均無顯著差異(表4)。推測(cè)外源乙烯和(NH4)2SO4調(diào)節(jié)玉米Cd耐受能力, 與葉片ATP-S活性和Cys含量的上升導(dǎo)致GSH的合成增強(qiáng)相關(guān), 而不是通過增強(qiáng)NPT和PCs等重金屬螯合劑的合成。

表4 外源乙烯和(NH4)2SO4處理對(duì)玉米幼苗硫代謝的影響

同行不同小寫字母表示各處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among treatments Sat 0.05 level.

2.4 BSO對(duì)外源乙烯誘導(dǎo)的玉米Cd耐受性的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證GSH在乙烯誘導(dǎo)玉米Cd耐受過程中的作用, 本研究利用GSH專一性合成抑制劑BSO, 研究其對(duì)GSH含量、H2O2含量、Rubisco酶活性和光合作用的影響。由表5可知, 添加BSO對(duì)玉米幼苗中的GSH合成有顯著負(fù)作用, Cd+BSO處理與Cd處理相比, GSH含量顯著降低, 在Cd+BSO處理的基礎(chǔ)上, 添加乙烯可以提升玉米幼苗中GSH含量, 同時(shí)添加乙烯和(NH4)2SO4, GSH含量進(jìn)一步提升, 但相對(duì)單獨(dú)Cd處理(T1)的含量要顯著降低; 另一方面, 添加BSO可導(dǎo)致H2O2含量顯著上升, 進(jìn)而影響光合作用, 導(dǎo)致Rubsico酶活性、光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳降低(表5)。結(jié)果表明, 外源乙烯緩解Cd脅迫對(duì)玉米的毒害作用與GSH生物合成的增強(qiáng)緊密相關(guān)。

表5 谷胱甘肽合成抑制劑丁硫氨酸-亞砜亞胺(BSO)對(duì)玉米幼苗谷胱甘肽、H2O2含量和光合作用的影響

同行不同小寫字母表示各處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters in the same row indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

2.5 外源乙烯對(duì)玉米體內(nèi)Cd含量與亞細(xì)胞分布的影響

從表6可知, Cd脅迫可導(dǎo)致玉米葉片與根中Cd含量急劇上升。在添加外源乙烯以后, 相對(duì)Cd處理, 葉片中的Cd含量下降50.55%, 而根中Cd含量則上升71.14%。進(jìn)一步進(jìn)行Cd的亞細(xì)胞分布分析, 發(fā)現(xiàn)葉片細(xì)胞壁中Cd含量上升, 但變化不顯著; 在細(xì)胞器和含有液泡的可溶性組分中, Cd含量顯著下降(表6)。根細(xì)胞壁和可溶性組分中的Cd含量顯著上升, 而在細(xì)胞器中的含量則有少量降低(表6)。結(jié)果表明, 根細(xì)胞壁的固定和液泡區(qū)室化作用, 可降低Cd向玉米葉片中的轉(zhuǎn)移。

表6 外源乙烯對(duì)Cd脅迫下玉米幼苗Cd分布的影響

不同小寫字母表示各處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

Cd是環(huán)境中廣泛存在的一種對(duì)植物和動(dòng)物均能產(chǎn)生毒害的污染物, 它易被高等植物體吸收, 并引起植物生長(zhǎng)抑制作用, 其中Cd脅迫誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生ROS, 而產(chǎn)生氧化脅迫, 是抑制植物生長(zhǎng)的主要原因。ROS可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化, 繼而破壞植物器官和組織, 胞內(nèi)電解質(zhì)流出, 電導(dǎo)率升高[30]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物, 可反映逆境脅迫對(duì)植物造成的傷害程度[30]。劉艷菊[15]研究表明, 添加外源乙烯可以顯著降低擬南芥幼苗中Cd脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2和MDA含量。本研究結(jié)果亦表明, 與Cd處理相比, 添加外源乙烯或(NH4)2SO4可降低玉米幼苗葉片與根中的H2O2和MDA含量, 同時(shí)添加乙烯和(NH4)2SO4的效果最佳, 表明乙烯與(NH4)2SO4對(duì)緩解玉米幼苗Cd毒害具有協(xié)同效應(yīng)。

通常植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的過量ROS可以通過抗氧化酶促反應(yīng)(SOD、CAT等)和非酶促反應(yīng)(AsA、GSH等)加以清除[30]。劉艷菊[15]發(fā)現(xiàn)外源乙烯處理可以降低Cd脅迫下擬南芥中的SOD和GR活性, 而CAT活性增強(qiáng)。Abozeid等[31]研究發(fā)現(xiàn), 外源乙烯可以促進(jìn)Cd脅迫油菜()幼苗SOD、CAT等抗氧化酶活性, 表明SOD、CAT等抗氧化酶在外源乙烯介導(dǎo)的擬南芥、油菜Cd耐受過程中發(fā)揮重要作用。而本研究發(fā)現(xiàn), Cd脅迫下補(bǔ)充外源乙烯或(NH4)2SO4, SOD與CAT活性顯著降低, 與上述研究結(jié)果不一致, 表明乙烯處理后的玉米幼苗中有其他機(jī)制參與解Cd毒過程, 以清除過量的ROS。為此, 我們測(cè)定了部分抗氧化物質(zhì)(AsA、GSH)在Cd、Cd+乙烯、Cd+(NH4)2SO4處理下玉米幼苗中的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米幼苗中AsA與GSH含量在Cd處理后上升(相對(duì)CK), 在添加外源乙烯和(NH4)2SO4以后, 其含量得到進(jìn)一步顯著提升, 這與外源NO對(duì)Cd處理下芥菜()幼苗中AsA、GSH等的變化趨勢(shì)一致[32]。表明外源乙烯或(NH4)2SO4可能與外源NO的作用機(jī)理類似, 都是通過抗氧化物質(zhì)非酶促反應(yīng)清除植物中Cd處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS, 而非通過抗氧化酶促反應(yīng)。

Cd處理可嚴(yán)重影響植物光合作用, 如Cd處理下的芥菜, 與光合作用緊密相關(guān)的葉綠素含量和Rubisco酶活性相對(duì)對(duì)照顯著降低, 從而影響了芥菜的光合作用; 而在Cd處理的基礎(chǔ)上, 添加外源乙烯、S或者NO, 均可緩解Cd處理造成的芥菜幼苗光合抑制作用, 這與葉綠素合成和Rubisco酶活性的增強(qiáng), 以及葉片中氣孔的完整性和開張緊密相關(guān)[14,21,33]。本研究亦發(fā)現(xiàn)外源乙烯與(NH4)2SO4處理可通過顯著提升Rubisco酶活性, 從而減輕Cd處理對(duì)玉米幼苗光合作用的影響。

植物細(xì)胞中一些非蛋白硫醇化合物(NPT, PCs)在植物體內(nèi)可以與Cd、Pb等重金屬離子進(jìn)行螯合, 從而起到解毒和平衡植物體內(nèi)重金屬水平的作用[8]。PCs是植物中報(bào)導(dǎo)最多、作用最強(qiáng)的重金屬螯合劑之一, 它可將細(xì)胞質(zhì)中低分子量Cd螯合, 然后轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中, 并在液泡中聚合形成性狀穩(wěn)定的高分子量復(fù)合物, 從而解除Cd對(duì)植物的毒害[34]。許多研究表明, 添加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑, 可以促進(jìn)植物體內(nèi)硫代謝物(NPT、PCs、GSH)的合成, 如添加外源S, 可促進(jìn)小白菜()幼苗中PCs、AsA和GSH的合成, 從而提升小白菜幼苗的Cd耐受能力[35-36]; 外源NO亦可以通過促進(jìn)芥菜幼苗硫代謝(GSH、PCs、NPT等)而增強(qiáng)其在Cd處理環(huán)境中的生長(zhǎng)[21,37]。本研究發(fā)現(xiàn), 與單獨(dú)Cd處理相比, 添加外源乙烯和(NH4)2SO4處理可顯著提升玉米幼苗中ATP-S和GR酶活性, Cys、AsA和GSH含量顯著上升, 而對(duì)NPT和PCs含量則無明顯影響。推測(cè)外源乙烯主要通過促進(jìn)葉片AsA和GSH等硫代謝物的合成, 以保障玉米幼苗在Cd處理環(huán)境中的生長(zhǎng), 而不是通過提升NPT、PCs的作用。為驗(yàn)證該推論, 我們利用GSH合成抑制劑BSO處理乙烯和Cd脅迫下的玉米幼苗, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 添加BSO可導(dǎo)致葉片GSH含量降低, H2O2含量顯著上升, 進(jìn)而導(dǎo)致Rubsico酶活性、光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳降低, 影響光合作用, 這些結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了我們推論的可靠性。也有研究發(fā)現(xiàn)石竹()[38]、天藍(lán)遏藍(lán)菜()[39]的Cd超富集能力與PCs、NPT等含量的高低無關(guān)。因此, 在外源乙烯介導(dǎo)的玉米幼苗Cd耐受過程中有其他作用機(jī)制起著關(guān)鍵作用。

細(xì)胞壁是植物抵御重金屬脅迫的第一道屏障, 其中的草酸氧化酶、果膠、半纖維素可以與Cd2+結(jié)合, 降低Cd向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量, 從而降低Cd向地上部位的運(yùn)輸量[28,37]。為進(jìn)一步分析外源乙烯處理對(duì)玉米幼苗中Cd分布的影響, 我們測(cè)定了玉米葉片和根, 及其亞細(xì)胞中的Cd含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源乙烯處理可以顯著降低葉片中Cd含量, 而在根中的含量則顯著上升。亞細(xì)胞分析結(jié)果表明, 外源乙烯處理對(duì)葉片中細(xì)胞壁的Cd含量影響不顯著, 而在細(xì)胞器和含有液泡的可溶性組分中的含量則急劇降低; 根細(xì)胞壁和可溶性組分中的Cd含量顯著上升, 在細(xì)胞器中的含量變化無顯著性差異。結(jié)果表明, 玉米幼苗根細(xì)胞壁固定作用和液泡區(qū)室化作用, 在外源乙烯介導(dǎo)的玉米幼苗Cd耐受過程中發(fā)揮重要作用。

因此, 外源乙烯增強(qiáng)玉米幼苗Cd耐受性的可能機(jī)制為: ①增強(qiáng)玉米根細(xì)胞壁對(duì)Cd的吸附作用和液泡的區(qū)室化作用, 減少Cd向地上部位的轉(zhuǎn)運(yùn)。②對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)至葉片的Cd, 則通過提升幼苗葉片GSH的合成和AsA含量, 增強(qiáng)Cd誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的清除能力, 從而緩解Cd對(duì)葉片的毒害。

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Effect of exogenous ethylene on physiological metabolism ofseedlings under cadmium stress*

LIU Juan1, ZHAO Huanrui1, LIU Yonghua1, WANG Jinghui2

(1. College of Life Science, College of Yulin, Yulin 719000, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, College of Yulin, Yulin 719000, China)

There has been increasing heavy metals [especially cadmium (Cd)] pollution in farmlands in China. Studies have identified the crucial role of exogenous ethylene in the reversal of Cd stress in plants such asmustard. However, few studies have been done on maize (), which is the second largest staple crop in China. To investigate the potential process by which exogenous ethylene alleviates Cd stress in maize, hydroponic experiments were conducted. The experiments included a treatment that served as a blank control and others that were Cd and (NH4)2SO4treatments. Changes in physiological indexes of maize seedling leaf along with subcellular distribution of Cd in leaves and roots of the plant were determined under Cd treatment, exogenous ethylene treatment and exogenous sulphur treatment. The results suggested that H2O2and malondialdehyde (MDA) contents of maize seedling leafdecreased under exogenous ethylene and exogenous (NH4)2SO4treatments, comparing with Cd treatment alone. Also, the rate of net photosynthesis was promoted by 1.23 times and 1.22 times respectively under exogenous ethylene and exogenous (NH4)2SO4treatments. The activity of antioxidant enzymes [superoxide diamutase (SOD), catalase (CAT)] significantly decreased, while the contents of antioxidants [ascorbic acid (AsA) and glutathione (GSH)] significantly increased under exogenous ethylene or exogenous (NH4)2SO4treatments with Cd stress. The results suggested that exogenous ethylene reduced Cd-induced oxidative stress and the degree of lipid peroxidation by enhancing non-enzymatic antioxidant reaction. However, it did not affect enzymatic antioxidant reaction, but then promoted photosynthetic processes. Compared with Cd treatment alone, the activities of ATP sulfurylase and glutathione reductase (GR), and the contents of cysteine and GSH in maize seedlings increased respectively by 54.43%, 27.93%, 50.77%, and 49.85% with exogenous ethylene treatment. However, there was no significant change in non-protein thio (NPT) and phytochelatins (PCs) contents. The results showed that ethylene potentiated GSH biosynthesis to resist Cd conditions. To show this that was the case, a GSH biosynthetic inhibitor — buthionine sulfoximine (BSO) — was applied on maize seedlings under Cd and exogenous ethylene conditions. Compared with Cd plus exogenous ethylene treatment, BSO significantly decreased GSH content, increased H2O2content and reduced net photosynthesis rate. Furthermore, Cd content in roots significantly increased while it decreased in leaves after treatment with exogenous ethylene under Cd stress. Further analysis showed that Cd content in cell wall and vacuole of roots was enhanced with exogenous ethylene treatment. Totally, exogenous ethylene reversal of the effect of Cd stress on maize was a complex process involving the promotion of GSH and AsA contents and Cd distribution in roots. On the one hand, exogenous ethylene treatment enhanced non-enzymatic antioxidant capacity by increasing the contents of GSH and AsA, and not by improving the activities of antioxidant enzymes nor chelating NPT and PC in maize leaf. On the other hand, translocation of Cd from maize root to leaf was reduced by enhancing Cd sequestration in cell walls and vacuoles of maize root. The results provided the fundamental information for the application of ethylene in the reversal of heavy metal stress.

Cadmium; Ethylene;; Physiological mechanism; Sulphur; Seedling

LIU Juan, E-mail: c253781777@126.com

Oct. 15, 2018;

Dec. 24, 2018

Q945.78

A

2096-6237(2019)05-0757-09

10.13930/j.cnki.cjea.180915

2018-10-15

2018-12-24

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31760209), the Special Research Program in Science of Education Department of Shaanxi Province (17JK0898), and the Start Research Grant for PhD of College of Yulin (16GK08).

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31760209)、陜西省教育廳專項(xiàng)科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(17JK0898)和榆林學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(16GK08)資助

劉娟, 趙歡蕊, 劉永華, 王鏡惠. 外源乙烯對(duì)鎘處理下玉米幼苗生理代謝的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(中英文), 2019, 27(5): 757-765

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劉娟, 主要從事植物生理方面的研究。E-mail: c253781777@126.com