原發(fā)性肝癌癌組織腫瘤抑制因子候選基因1表達(dá)與病理特征的關(guān)系

王媛 惠雙 張成輝 郭宏強(qiáng)

原發(fā)性肝癌屬常見惡性腫瘤，有報(bào)道稱其發(fā)生為一個(gè)多基因共同參與的復(fù)雜過程，涉及肝細(xì)胞損傷修復(fù)、抑癌基因、腫瘤基因等，其中腫瘤抑制基因在抑制腫瘤發(fā)生過程中起著重要作用[1]。近年有資料顯示，腫瘤抑制因子候選基因1(Tumor suppressor candidate 1，TUSC1)作為一種新型抑癌基因，在甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌中呈低水平表達(dá)，且其表達(dá)水平較正常組織低[2]。而在原發(fā)性肝癌中，TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究納入78例原發(fā)性肝癌患者，進(jìn)行回顧性分析，旨在深入探討原發(fā)性肝癌癌組織中TUSC1表達(dá)與病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2016年10月至2018年10月于我院收治的78例原發(fā)性肝癌患者為對(duì)象，進(jìn)行回顧性分析，獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①與《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》[3]中原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)相符，經(jīng)病理學(xué)確診；②年齡≥18歲，首次發(fā)??；③獲患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肺、腎等重要器官疾??；②伴其他部位惡性腫瘤者；③入組前1周接受放化療、介入治療、分子靶向藥物治療、微波消融等抗腫瘤治療；④伴重度肝硬化所致肝功能嚴(yán)重異常，或腹水、黃疸明顯者。按TUSC1 mRNA檢測結(jié)果，將78例患者分為TUSC1 mRNA表達(dá)組(55例)及缺失組(23例)；按TUSC1蛋白檢測結(jié)果，將其分為TUSC1蛋白表達(dá)組(45例)及缺失組(33例)。

二、 方法

(一)TUSC1基因mRNA表達(dá)檢測 取患者60 mg癌組織，剪碎研磨，加入TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)1 mL，TRIzol法提取樣本總RNA，行RNeasy Mini Kit純化。以超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000型，北京百道亨儀器設(shè)備有限公司)測定RNA濃度和A260/A280吸光度比值(確保在1.8～20.0之間)。依據(jù)基因序列，行β-actin肌動(dòng)蛋白(β-actin)、TUSC1基因引物序列設(shè)計(jì)(見表1)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)體系：總體積、內(nèi)含模板分別為25 μL、2 μL，上下游引物均為0.5 μL，TaKaRa Taq HS 0.25 μL，10聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)緩沖液5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸混合物4 μL，其余補(bǔ)水25 μL。取5 μL PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳方法，以2%瓊脂糖凝膠、100V電壓電泳30 min，行反應(yīng)產(chǎn)物檢測，后采用Quantity-One圖像分析(成都百樂科技有限公司)，計(jì)算樣本TUSC1表達(dá)水平。2720型PCR基因擴(kuò)增儀購自孚約安防設(shè)備(上海)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒由美國Thermo公司生產(chǎn)；TUSC1、β-actin引物序列由美國Abmart公司合成。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

(二)TUSC1蛋白表達(dá)檢測方法 取25 μg蛋白，使用20 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(晶美生物工程有限公司)，行電泳處理。半于法轉(zhuǎn)膜后使用50 g/L脫脂奶粉(南京松冠生物科技有限公司)室溫封閉60 min，將1∶1 000的1Tris-HCl緩沖液稀釋的TUSC1一抗及1∶5 000的內(nèi)參β-actin一抗加入其中。4 ℃過夜后以Tris-HCl緩沖液洗膜3次，將1∶5 000的1Tris-HCl緩沖液稀釋的二抗加入其中，室溫60 min。1Tris-HCl緩沖液洗膜3次，暗室內(nèi)行增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)顯影，曝光。以Quantity-One生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)TUSC1蛋白表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

三、觀察指標(biāo)

比較患者癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平，分析其臨床病理特征與癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)的關(guān)系，并觀察TUSC1 mRNA表達(dá)與TUSC1蛋白表達(dá)的一致性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 原發(fā)性肝癌癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)比較

原發(fā)性肝癌癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表2。

表2 原發(fā)性肝癌癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)比較

二、原發(fā)性肝癌病理特征與TUSC1 mRNA表達(dá)的關(guān)系

TUSC1 mRNA表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤類型、HBsAg無明顯關(guān)系(P>0.05)，但早期(TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期)者TUSC1 mRNA陽性表達(dá)率顯著低于中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)者(P<0.05)，高、中分化者TUSC1 mRNA陽性表達(dá)率顯著低于低、未分化者(P<0.05)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者TUSC1 mRNA陽性表達(dá)率顯著高于肝內(nèi)無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，伴門靜脈癌栓者TUSC1 mRNA陽性表達(dá)率顯著高于不伴門靜脈癌栓者(P<0.05)。見表3。

三、原發(fā)性肝癌病理特征與TUSC1蛋白表達(dá)的關(guān)系

TUSC1 蛋白表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤類型、HbsAg無明顯關(guān)系(P>0.05)，但中晚期(TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期)者TUSC1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于早期(Ⅰ、Ⅱ期)者(P<0.05)，高、中分化者TUSC1蛋白陽性表達(dá)率顯著低于低、未分化者(P<0.05)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者TUSC1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于肝內(nèi)無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，伴門靜脈癌栓者TUSC1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于不伴門靜脈癌栓者(P<0.05)。見表4。

表3 原發(fā)性肝癌病理特征與TUSC1 mRNA表達(dá)的關(guān)系(例數(shù)，%)

四、原發(fā)性肝癌患者TUSC1 mRNA表達(dá)與其蛋白表達(dá)的一致性分析

原發(fā)性肝癌患者TUSC1 mRNA表達(dá)與TUSC1蛋白表達(dá)具有良好一致性(kappa為0.56)，見表5。

表4 原發(fā)性肝癌病理特征與TUSC1蛋白表達(dá)的關(guān)系(例數(shù)，%)

表5 原發(fā)性肝癌患者TUSC1 mRNA表達(dá)與其蛋白表達(dá)的一致性分析

討 論

TUSCI已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，其功能喪失及癌基因激活已成為癌變的分子基礎(chǔ)。TUSCI基因?qū)傩滦鸵职┗?，處于人類染色體9P21.2，是鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)重要成員，其編碼的蛋白質(zhì)為寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的亞基，在蛋白質(zhì)折疊過程中的N端糖基化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。TUSC1突變?nèi)笔Щ虍惓１磉_(dá)可改變N端糖基化進(jìn)程，而異常N端糖基化會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)及功能異常改變，促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤細(xì)胞。趙愛國等[4]研究表明，TUSC1與癌癥之間關(guān)系密切，已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn) TUSC1表達(dá)降低或缺失，如甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌等。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，原發(fā)性肝癌癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白呈低表達(dá)，可能與原發(fā)性肝癌的惡性進(jìn)程有關(guān)。國外研究表明，TUSC1基因在人類許多腫瘤中存在低表達(dá)，而關(guān)于其在肝臟中表達(dá)的研究報(bào)道較少[5]。Rimkus等[6]報(bào)道TUSC1在乳腺癌中的表達(dá)明顯下調(diào)，TUSC1缺失可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，而TUSC1缺失可能與TUSC1基因啟動(dòng)子區(qū)過甲基化有關(guān)。陳皓等[7]認(rèn)為TUSC1基因啟動(dòng)子的甲基化為基因失活關(guān)鍵機(jī)制，與腫瘤惡性程度有關(guān)。本研究中，筆者認(rèn)為TUSC1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)下調(diào)可能與TUSC1基因啟動(dòng)子區(qū)過甲基化有關(guān)。一旦出現(xiàn)TUSC1基因啟動(dòng)子區(qū)過甲基化，會(huì)抑制TUSC1基因轉(zhuǎn)錄，使TUSC1基因呈低水平表達(dá)，導(dǎo)致TUSC1基因解毒、抑癌功能減弱，提示TUSC1甲基化可能促進(jìn)原發(fā)性肝癌發(fā)病進(jìn)程，具體機(jī)制有待更大樣本進(jìn)行深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，TUSC1 mRNA及其蛋白表達(dá)與TNM分期、分化程度、門靜脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TUSC1表達(dá)下調(diào)可進(jìn)一步增加原發(fā)性肝癌侵襲性、增殖能力及惡性程度，與患者腫瘤惡性進(jìn)展程度有關(guān)。夏琬君等[8]報(bào)道通過檢測65例浸潤性乳腺癌癌組織中啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌旁組織未出現(xiàn)TUSC1基因啟動(dòng)子甲基化，對(duì)應(yīng)乳腺癌組織中甲基化水平占61.5%；而癌旁組織TUSC1蛋白均有明顯表達(dá)，對(duì)應(yīng)乳腺癌組織出現(xiàn)蛋白表達(dá)占29.2%，證實(shí)甲基化發(fā)生率與蛋白表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，表明TUSC1基因啟動(dòng)子甲基化為基因失活關(guān)鍵機(jī)制，與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，患者TUSC1 mRNA表達(dá)與TUSC1蛋白表達(dá)具有良好一致性，提示TUSC1 mRNA陽性表達(dá)者多伴有TUSC1蛋白陽性表達(dá)。

綜上，癌組織TUSC1 mRNA及蛋白的聯(lián)合檢測是原發(fā)性肝癌的有效診斷手段，可早期評(píng)估原發(fā)性肝癌肝內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)移，判斷是否合并門靜脈癌栓，臨床上應(yīng)引起足夠重視。但本研究由于樣本量偏小，未涉及患者預(yù)后與TUSC1表達(dá)間的關(guān)系，故今后仍需深入調(diào)查研究。