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    CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型中肝臟巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群變化的初步分析

    2019-05-07 12:49:36唐穎悅李靜雷曉紅李春敏曾民德茅益民
    肝臟 2019年4期
    關(guān)鍵詞:亞群淋巴細(xì)胞纖維化

    唐穎悅 李靜 雷曉紅 李春敏 曾民德 茅益民

    慢性肝臟炎癥導(dǎo)致的肝纖維化、肝硬化在全球每年造成超過100萬人死亡[1]。盡管肝星狀細(xì)胞(HSC)激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),但在肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)程中有多種細(xì)胞參與,包括肝實質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(庫普弗細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞等。如庫普弗細(xì)胞分泌的TGFβ1、血小板衍生生長因子(PDGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等是HSC激活的關(guān)鍵,其分泌的IL-4和IL-13可直接刺激MFB的膠原合成[2];T淋巴細(xì)胞主要亞群Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(如IFN-γ和IL-12)能抑制肝纖維化,而Th2分泌的IL-13可促進(jìn)膠原合成[3];NKT細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子包括IFNγ和IL-4,對肝纖維化的進(jìn)展具有雙向作用[4]。NK細(xì)胞可殺傷活化早期的HSC和衰老的肌纖維母細(xì)胞,顯著抑制肝纖維化[5]。B細(xì)胞缺失可減少膠原的沉積并通過抗體不依賴途徑緩解肝纖維化發(fā)展[6]。本研究通過多色流式技術(shù)觀察CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型中各免疫細(xì)胞的變化,探討其可能參與的調(diào)節(jié)機制。

    材料與方法

    一、 實驗動物

    雄性C57BL/6小鼠,10~12周齡,購于上海斯萊克動物實驗中心。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于上海睿太莫斯生物科技有限公司實驗動物中心,SPF級獨立通風(fēng)籠,自由飲食。

    二、 主要試劑及儀器

    CCl4購于國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;橄欖油購于上海生工生物工程有限公司;Percoll購于德國GE Healthcare(40501ES60);紅細(xì)胞裂解液購于上海翊圣生物科技有限公司(40401ES60);RPMI1640購于美國Gibco;流式細(xì)胞抗體均購自美國Biolegend。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司(BD LSRFortesssa X20);全自動脫水機、石蠟包埋機、脫蠟機均來自于德國Leica公司。

    三、動物分組及模型建立

    14只雄性C57BL/6小鼠隨機分成2組,每組7只。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,實驗組小鼠予腹腔注射20% CCl4溶液(1 mL/kg),每周2次,持續(xù)6周;對照組小鼠予腹腔注射橄欖油(1 mL/kg),實驗期間自由飲水,飼養(yǎng)溫度控制在(24±2)℃,濕度為(50±5)%,每天換水和墊料,每周稱量體質(zhì)量。在末次注射CCl448 h后對實驗組和對照組小鼠進(jìn)行安樂死,并收集外周血和肝臟樣本。

    四、HE、Masson染色,肝纖維化病理評分

    肝組織4%多聚甲醛固定24 h,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋并切片。HE染色:肝組織石蠟切片二甲苯脫蠟,酒精梯度濃度脫水,蘇木素染色30 s、水洗30 s,1%鹽酸酒精3 s、水洗30 s、1% 氨水30 s,伊紅染色1 min,二甲苯透明和中性樹膠封片。Masson染色:肝組織石蠟切片二甲苯脫蠟,酒精梯度濃度脫水,酸性麗春紅品紅染色1 min,放入0.2%冰醋酸3 s,1%磷鉬酸10 s,0.2%冰醋酸3 s,0.2%冰醋酸1 s,梯度酒精脫水,二甲苯透明并中性樹膠封片。按照Metavir分級標(biāo)準(zhǔn)將肝臟纖維化分為5期:F0為無肝纖維化;F1為輕度肝纖維化;F2為顯著肝纖維化或明顯肝纖維化;F3為進(jìn)展期肝纖維化;F4為肝硬化。

    五、流式細(xì)胞分析

    小鼠肝臟沖洗干凈,取出并研磨,將細(xì)胞進(jìn)行離心、沖洗,用Percoll分離液分離,棄上清后加紅細(xì)胞裂解液離心,用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸調(diào)整計數(shù)細(xì)胞為106/mL,制成肝臟單細(xì)胞懸液備用。取肝臟單細(xì)胞懸液100 μL, 分別加入FITC anti-mouse CD3(17A2)、APC anti-mouse/human CD45R/B220(RA3-6B2)、PE/Cy7 anti-mouse NK-1.1(PK136)、APC anti-mouse CD206 (MMR)(C068C2)、Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c(N418)、Brilliant Violet 421TManti-mouse F4/80(BM8)、Zombie NIRTMFixable Viability Kit各1.5 μL 輕柔混合,4℃孵育30 min后加入 PBS 洗滌2次,上機檢測,用FlowJo軟件進(jìn)行后期數(shù)據(jù)分析。

    六、統(tǒng)計學(xué)方法

    采用 SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,采用Graph Pad Prism 7.0進(jìn)行繪圖,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、構(gòu)建CCl4誘導(dǎo)肝纖維化疾病模型

    對照組小鼠肝臟表面呈紅色,質(zhì)地柔軟且富有彈性(圖1A),而實驗組小鼠肝臟略小且質(zhì)硬,表面呈灰黃色,散布大小結(jié)節(jié)(圖1B)。HE染色可見對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞形態(tài)正常,未見明顯肝纖維化(圖1C);而實驗組小鼠肝小葉纖維明顯增多,正常肝小葉減少,多數(shù)被假小葉替代,網(wǎng)狀纖維(假小葉)內(nèi)可見炎細(xì)胞彌漫性浸潤,肝細(xì)胞排列紊亂且出現(xiàn)彌漫散在的脂肪變性(圖1D)。Masson染色可見實驗組小鼠肝臟纖維化沉積明顯重于對照組,平均病理評分達(dá)到F3(圖1E、1F)。

    與對照組小鼠相比,實驗組小鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05),同時肝濕重相對下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。實驗組小鼠外周血ALT及AST顯著高于對照組(P<0.001),在血脂方面,實驗組TG和LDL-C均顯著上升(P<0.05),TC高于對照組,而HDL-C低于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

    圖1 對照組和實驗組小鼠肝臟肉眼觀、HE以及Masson染色圖像(100)

    二、 CCl4模型小鼠肝臟巨噬細(xì)胞亞群比例變化

    圖2A所示為多色流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞亞群的邏輯策略圖。如圖2B所示,實驗組F4/80+巨噬細(xì)胞比例高于對照組,數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示實驗組巨噬細(xì)胞比例達(dá)到(13.33±1.91)%,而對照組僅為(8.17±2.00)%,(P<0.001)(圖2C)。進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞亞群的比例發(fā)現(xiàn),實驗組小鼠肝臟中存在大量M1型巨噬細(xì)胞,而對照組小鼠肝臟中M1型細(xì)胞比例則維持在一個較低的水平;兩組中主要發(fā)揮抑制炎癥作用的M2型巨噬細(xì)胞比例均較低(圖2D)。統(tǒng)計結(jié)果表明,以CD11c+標(biāo)記M1型細(xì)胞在實驗組小鼠中達(dá)到了(24.19±3.07)%,明顯高于對照組的(12.67±4.69)%,(P<0.01)(圖2E);以CD206+標(biāo)記M2型細(xì)胞比例在兩組間則無明顯變化(圖2F)。提示在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠疾病模型中,大量巨噬細(xì)胞浸潤肝臟組織,且主要是以促炎作用為主的M1型巨噬細(xì)胞。

    三、 CCl4模型小鼠肝臟淋巴細(xì)胞亞群比例變化

    圖3A所示為多色流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞亞群的邏輯策略圖。如圖3B、3C、3D所示,實驗組小鼠肝臟CD3+T淋巴細(xì)胞比例(20.17±4.07)%與對照組(36.00±4.61)%相比明顯下降(P<0.01),而CD45R+B淋巴細(xì)胞比例在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時,如圖3E、3F、3G所示,實驗組小鼠肝臟中NK-1.1+CD3+NKT細(xì)胞比例較對照組明顯降低;而兩組間NK-1.1+NK細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此我們認(rèn)為在肝纖維化疾病模型中肝臟局部定植的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞的比例出現(xiàn)明顯下降,而B細(xì)胞和NK細(xì)胞則沒有發(fā)生明顯改變。

    討 論

    肝臟免疫細(xì)胞參與肝纖維化的進(jìn)展。Karlmark等[7]觀察到長期CCl4刺激會導(dǎo)致肝內(nèi)CD11b+F4/80+細(xì)胞比例明顯升高。針對慢性肝損傷和纖維化患者的研究也發(fā)現(xiàn),這些患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多[8]。本研究發(fā)現(xiàn),慢性肝纖維化小鼠的肝臟組織中庫普弗細(xì)胞比例明顯升高,并且以M1型巨噬細(xì)胞為主,實驗組M1型巨噬細(xì)胞的比例明顯高于對照組,但是M2型巨噬細(xì)胞的比例在兩組間并無顯著差別。有研究指出,M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎因子如IL-1β、INF-γ、MCP-1和TNF-α,加重肝臟損傷。肝損傷后大量庫普弗細(xì)胞活化可通過NF-κB信號通路啟動TGF-β、TNF-α等細(xì)胞因子的合成和分泌,進(jìn)而激活HSC,加快肝纖維化發(fā)展[9]。巨噬細(xì)胞的分化還會影響肝纖維化環(huán)境下T細(xì)胞亞群的構(gòu)成比,主要影響Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。與此同時,HSC活化后分泌趨化因子如CCL3, CCl4, CXCL1, CXCL2或者CXCL10,可通過TLR4依賴的信號途徑促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的向肝臟組織的趨化作用。

    肝纖維化晚期會出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例明顯降低,這一變化將加速CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

    表1 對照組和實驗組小鼠一般情況、生化指標(biāo)、肝纖維化評分比較(±s)

    注:與對照組相比,*P<0.05,***P<0.001

    圖2 對照組和實驗組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞及其亞型檢測結(jié)果

    多項研究發(fā)現(xiàn),肝硬化患者外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,疾病晚期表現(xiàn)更明顯。因此,本研究分析了CCl4誘導(dǎo)慢性肝纖維化小鼠肝臟局部組織中T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的分布情況。與對照組相比,實驗組小鼠肝臟組織中,T細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例均明顯降低,這與患者中觀察到的現(xiàn)象相似。但是,兩組間B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞比例并無顯著變化。以上結(jié)果提示,在肝纖維化晚期T細(xì)胞和NKT細(xì)胞的比例降低,可能會加速體內(nèi)免疫功能失衡,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。

    綜上,在CCl4誘導(dǎo)慢性肝纖維化小鼠模型中,肝臟內(nèi)以M1型細(xì)胞為主的庫普弗細(xì)胞浸潤明顯,而局部浸潤的NKT細(xì)胞和T細(xì)胞比例則明顯減少,提示M1型巨噬細(xì)胞可能在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且可能成為肝纖維化治療的潛在靶點。因此,后續(xù)可以針對M1型巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的作用機制開展更深入的研究。

    圖3 對照組和實驗組小鼠肝臟T、B、NK、NKT淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果

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